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《西北农林科技大学》 2008年
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腺病毒介导重组人蛋白C及人神经生长因子Beta基因在兔乳腺中高效表达的研究

肖波  
【摘要】: 基因工程蛋白药物的生产是目前国际上研究的热点。如何经济、高效的生产这类蛋白也一直是人们努力探索的一个问题。目前,虽然有细菌、真菌、昆虫细胞、动物细胞、转基因植物、转基因动物等几种外源蛋白表达系统,但他们均存在着各种缺陷。为探讨利用动物乳腺作为表达系统来生产外源蛋白,本研究选取了两种药用蛋白,即一种是存在于人血浆中的药用蛋白——人蛋白C(hPC),另一种是用于治疗神经性病变的细胞因子——人神经生长因子beta(hNGF-β)作为目标蛋白,通过腺病毒介导,使这两种蛋白的cDNA基因在兔乳腺中高效表达,并在兔乳汁中获得有功能的目标蛋白。从而为腺病毒介导外源基因在动物乳腺中高效表达重组药用蛋白方法的进一步开发和生产提供技术和理论依据。 本研究主要包括以下内容:(1)提取人胚胎脏器组织中的总RNA,经RT-PCR,获得用于表达的hPC和hNGF-β的cDNA基因。通过对这两种cDNA进行测序分析,并将二者所编码的氨基酸序列与已发表的相应氨基酸序列进行比对,确定所扩增的cDNA的正确性。(2)真核表达载体的构建及其外源基因在培养细胞中的表达,证实构建入表达载体中的hPC和hNGF-βcDNA基因可用于表达;(3)细菌内同源重组法构建重组腺病毒载体;(4)重组腺病毒载体在HEK293细胞中的包装及重组腺病毒的扩增;(5)重组腺病毒中的外源基因在培养的乳腺上皮细胞中的表达;(6)将重组腺病毒注射到兔乳腺感染乳腺上皮细胞,分别检测兔乳汁中重组人蛋白C(rhPC)和重组人神经生长因子Beta(rhNGF-β)的表达情况,并经相应的活性鉴定,确定所表达蛋白有无相应的功能;(7)对所构建的两种表达rhPC载体进行表达效果的比较,通过优化载体进一步完善该技术体系。 主要研究结果如下: (1)通过RT-PCR法从人胚胎心脏和肝脏组织中分别获得了hNGF-β和hPC的cDNA基因。经DNA测序分析,所得hPC和hNGF-β的cDNA与Genbank中的相应序列一致。通过对这两种cDNA所编码的氨基酸序列分析,二者均与已发表的两种蛋白的氨基酸序列一致。 (2)以pcDNA3.1+、pIRES和pShuttle-CMV为基础质粒,构建了含有hPC及hNGF-βcDNA基因的真核表达载体p3PG和p3NG以及穿梭表达载体pShPG和pShNG。其中,载体中p3PG和p3NG含有新霉素抗性筛选标记基因和GFP报告基因,可对已转染的哺乳动物细胞进行抗性筛选,也可对目标蛋白基因的表达进行实时观测;pShPG、pShNG中含有GFP报告基因,可对目标蛋白基因的表达进行确定,提高了检测目标蛋白基因表达的效率,为rhPC及rhNGF-β的表达研究奠定了基础。 (3)构建了含有hPC cDNA基因的穿梭表达载体pShPF,内含有促进hPC向成熟转变所需蛋白Furin的cDNA基因。 (4)通过不同表达载体在CHO和HEK293细胞株中的表达,证实了所构建载体在哺乳动物细胞中表达的可能性,获得了hPC和hNGF-βcDNA在细胞的体外表达,为后面含hPC基因和hNGF-β基因的腺病毒载体的构建奠定了基础。 (5)将所构建并经鉴定正确的pShNG、pShPG和pShPF载体用Pme I酶切线性化,然后将所获得的线性化片断与Adeasy质粒共转化大肠杆菌BJ5183,或者直接用线性化的pShNG、pShPG和pShPF直接转化处于感受态且含有Adeasy质粒的大肠杆菌BJ5183,通过细菌内同源重组的方法获得了重组AdPG、AdPF和AdNG腺病毒载体。验证了“两步转化法”可大幅度提高细菌内同源重组制备腺病毒载体的效率。 (6)在培养的HEK293细胞中,进行了AdPG、AdPF、AdNG重组腺病毒的包装与扩增。通过重组腺病毒在兔乳腺上皮细胞中的表达研究,证实了重组腺病毒可感染乳腺上皮细胞并且表达目标蛋白。 (7)通过对兔乳腺的感染试验,高效表达了具有生物活性的rhNGF-β和rhPC, rhNGF-β的最高表达量为346μg/mL,rhPC的最高表达量达到958μg/mL。从而证实了以腺病毒为载体导入动物乳腺表达外源蛋白的可行性。 (8)通过对所构建的两种表达hPC的载体进行表达效果的比较,证实了furin对成熟hPC的表达起作用,但不如报道的效果较好,其原因可能是由于所构建的载体的差异而使furin表达量不同,从而造成hPC原肽不能完全被降解成成熟的hPC。 本研究利用腺病毒为载体,在兔乳腺中高效表达了rhPC和rhNGF-β。通过将furin基因构建入腺病毒载体中hPC基因的下游,促进了rhPC的成熟表达,表明通过优化腺病毒载体的构建可促进动物乳腺成熟表达外源基因的蛋白。rhPC和rhNGF-β的高效表达充分说明以腺病毒为载体,利用动物乳腺进行外源蛋白的生产是可行的。该方法进一步拓展了腺病毒载体的应用范围,无论在转基因技术理论领域,还是在基因工程药物生产研究方面,均具有重要意义,为转基因蛋白药物的生产开辟了一条新途径。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:Q78

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【参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 章金刚,卜凤荣;转基因动物与新一代血液制品[J];中国输血杂志;2001年05期
2 杨文宇,黄宗海,汤福祥,钱勇,车小燕;“两步转化法”高效制备携带自杀基因的重组腺病毒载体[J];第一军医大学学报;2004年02期
3 林炳英;林德钦;李梅;金志强;;利用转基因植物生产药用蛋白的研究进展[J];福建农业学报;2007年01期
4 韩玉刚,李建凡;动物生物反应器研究现状和进展[J];国外畜牧科技;2002年01期
5 张素,陈崇宏,郑志;神经生长因子的研究[J];海峡药学;2003年02期
6 王建,邓小明;活化蛋白C与脓毒症[J];中华急诊医学杂志;2003年03期
7 袁明霞;孙德君;杨万秋;;生物反应器及其应用——转基因动物生物反应器[J];吉林畜牧兽医;2007年06期
8 黄淑帧,陈美珏,黄英,张克忠,李华,卢大儒,陆建英,陈云弟,邱信芳,薛京伦,曾溢滔;乳汁中分泌有活性的人凝血因子Ⅸ的转基因羊的研制[J];科学通报;1998年07期
9 李征;毕跃东;曾献武;刘知微;;重组人活性蛋白C的基因克隆、表达载体构建以及在哺乳动物细胞中的高效表达[J];食品与药品;2006年06期
10 赵娟;何冰;江汉民;程秀玮;俞新大;;人神经生长因子基因在大肠杆菌中的克隆、表达及产物纯化[J];中国生物工程杂志;2006年06期
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 王洪岩,仲跻峰,刘文浩;动物乳腺生物反应器的研究进展[J];山东农业科学;2004年03期
2 张玉玲;张晶晶;刘凤军;张涌;;转人乳铁蛋白基因山羊乳腺上皮细胞的体外诱导表达[J];安徽农业科学;2009年32期
3 杨慧婷;王洪梅;侯明海;高运东;仲跻峰;何洪彬;;动物乳腺生物反应器研究进展[J];安徽农业科学;2011年11期
4 代长云;黄海军;向敏;陶弼菲;陈志华;高其双;吴建英;钱运国;;动物乳腺生物反应器研究进展[J];现代农业科技;2010年04期
5 孙国杰,桑润滋,李俊杰,韩建永;哺乳动物乳腺生物反应器的研究现状及存在问题[J];黄牛杂志;2002年03期
6 韩爱云,黄仁录,李建国;分子生物学技术在反刍动物营养中的应用[J];黄牛杂志;2005年04期
7 张进隆;;乳腺生物反应器主要产品研究现状[J];中国牛业科学;2010年04期
8 王爽;冷义福;张守纯;;植酸酶转基因动物的研究进展[J];当代畜禽养殖业;2010年05期
9 彭礼繁;罗光彬;薛可;;动物乳腺生物反应器的研究进展[J];当代畜禽养殖业;2010年07期
10 彭礼繁;罗光彬;薛可;;动物乳腺生物反应器的研究进展[J];当代畜禽养殖业;2010年09期
中国重要会议论文全文数据库 前9条
1 王治国;袁耀明;;乳腺上皮细胞体外培养的研究进展[A];第三届中国奶牛发展大会论文集[C];2008年
2 严泉剑;李六金;;核移植的现在和未来[A];中国实验动物学会青年科技协会第二届学术研讨会论文汇编[C];2001年
3 郑征;薛美兰;徐艳君;葛银林;;Construction of knock-in vector for FAT-1 transgenic mice[A];山东生物化学与分子生物学会2009年学术会议论文汇编[C];2009年
4 苟克勉;安晓荣;关宏;侯健;陈永福;;成年体细胞克隆的绵羊[A];2004年全国学术年会农业分会场论文专集[C];2004年
5 祝卫国;宋长绪;王贵平;杨增歧;王旭荣;黄忠;张春红;;猪Ⅱ型圆环病毒ORF1、ORF2基因串联重组腺病毒的构建[A];第一届中国养猪生产和疾病控制技术大会——2005中国畜牧兽医学会学术年会论文集[C];2005年
6 祝卫国;宋长绪;王贵平;杨增歧;王旭荣;黄忠;张春红;;猪圆环病毒Ⅱ型GD株ORF1基因重组腺病毒的构建及其表达[A];第一届中国养猪生产和疾病控制技术大会——2005中国畜牧兽医学会学术年会论文集[C];2005年
7 宋长绪;蒋智勇;王贵平;高向阳;赵亚华;;猪圆环病毒Ⅱ型GD株ORF2基因重组腺病毒的构建及其表达[A];第一届中国养猪生产和疾病控制技术大会——2005中国畜牧兽医学会学术年会论文集[C];2005年
8 张冰;王潇;张居农;;转基因克隆技术在羊上应用的研究进展[A];中国畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十五届学术研讨会论文集(上册)[C];2010年
9 张冰;王潇;张居农;;转基因克隆技术在羊上应用的研究进展[A];2010中国羊业进展[C];2010年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 马会明;转人β防御素3基因克隆牛的研制及检测[D];西北农林科技大学;2010年
2 孙杰;奶山羊乳腺消减文库构建及差异表达基因的研究[D];石河子大学;2009年
3 贺小英;利用重组腺病毒介导人端粒酶催化亚基(hTERT)制备牛乳腺细胞体外模型的研究[D];西北农林科技大学;2011年
4 吕自力;奶牛体细胞的纯化与人COL1α1 cDNA转染及核移植胚胎发育研究[D];石河子大学;2011年
5 张艳丽;转基因克隆法制作人溶酶体β-葡萄糖苷酶奶山羊乳腺生物反应器的研究[D];南京农业大学;2010年
6 王宁;精原干细胞途径建立hFIX转基因小鼠及Flt3配基乳腺生物反应器研究[D];复旦大学;2003年
7 严泉剑;兔组织工程膀胱实验研究[D];中国人民解放军第四军医大学;2003年
8 安志兴;绿色荧光蛋白融合基因在小鼠早期胚胎表达的研究[D];西北农林科技大学;2003年
9 龙章富;牛蛙生长激素基因克隆及其表达效应研究[D];四川大学;2003年
10 沈永才;人蛋白C的研制及其相关研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2004年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 孙英民;慢病毒载体制备转基因鸡技术平台的建立[D];河北农业大学;2011年
2 徐鹏;β-TCP/PDLLA复合材料制备及生物学性能的研究[D];武汉理工大学;2011年
3 刘义;TGEV S基因重组乳酸菌对小鼠和初生仔猪的口服免疫研究[D];吉林农业大学;2011年
4 张燕;转sfat-1基因乳腺上皮细胞体外培养研究[D];中国农业科学院;2011年
5 刘娣;重组人IL-24腺病毒表达载体的构建及对喉肿瘤细胞的生物学效应[D];济南大学;2011年
6 张作青;转il-4基因大白菜(Brassica pekinensis)及其杂交后代的分子检测及il-4遗传、表达研究[D];哈尔滨师范大学;2011年
7 冯运巩;Apo-B100介导的t-PA基因在鸡体内表达及其在卵黄中沉积的研究[D];河南科技大学;2010年
8 韦光辉;转牛生长激素基因鸡的研究[D];河南科技大学;2010年
9 李振红;转人抗癌基因P53鸡的研究[D];河南科技大学;2011年
10 王晓利;荧光蛋白标记的t-PA EGF缺失基因在鸡体内定位表达及靶向转运[D];河南科技大学;2011年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 魏道严,糜军,陈诗书;细菌内同源重组法高效制备含CD、TK融合自杀基因重组体腺病毒[J];癌症;2000年05期
2 张克忠,崇松,陈立,卢大儒,薛京伦,邱信芳;人凝血Ⅸ因子乳腺特异性表达载体在离体细胞和小鼠乳腺组织中表达的初步研究[J];复旦学报(自然科学版);1998年04期
3 陈溪,林忠平;利用转基因番茄生产人胰岛素的研究[J];分子植物育种;2003年04期
4 李文辉;快速构建腺病毒载体的新方法[J];国外医学.病毒学分册;1999年04期
5 陈学进,曾申明,李和平;动物生物反应器[J];国外畜牧科技;1998年01期
6 邱磊,郭葆玉;转基因动物生物反应器的基因构建与表达[J];国外医学.预防.诊断.治疗用生物制品分册;1999年05期
7 黄英,张克忠,黄文英,卢大儒,黄缨,马湛卢,任兆瑞,邱信芳,薛京伦,曾溢滔,黄淑帧;乳腺表达人凝血因子Ⅸ的转基因小鼠的研究[J];科学通报;1998年07期
8 范乔,刘宏迪,孙彤,赫荣乔;人神经生长因子β亚基的基因在P.pastoris和E.coli中的表达[J];科学通报;1999年06期
9 刘森,梁国栋;利用动物乳腺生物反应器生产药用蛋白[J];生物工程学报;2000年04期
10 谭晓红,杨晓,黄培堂;哺乳动物克隆的研究进展与应用前景[J];生物工程学报;2001年02期
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 熊光明;两个抑制性基因的克隆[J];中国兽医学报;1989年01期
2 王一民;;速生猪在澳获专利[J];世界科技研究与发展;1993年05期
3 王家旺,梁萧,林晨,张雪艳,吴旻;腺病毒E1和E4区基因共存的细胞系的建立[J];科学通报;1997年09期
4 张艳丽;靶向腺病毒[J];中国肿瘤生物治疗杂志;2001年02期
5 魏庆信,郑新民,赵浩斌,华文君,李莉,田永祥,魏雁;转基因猪研究进展[J];中国比较医学杂志;2005年02期
6 王俊伟;;腺病毒载体在基因治疗中的应用进展[J];科技信息;2011年20期
7 王守良,朱德钟,王华东,李光平,刘启富;鼻病毒与腺病毒抗原关系的观察[J];第三军医大学学报;1980年03期
8 孙国凤;;用转基因技术改良家畜还很困难[J];生物技术通报;1989年09期
9 苏霏,齐兵,齐义鹏;一种新的重组腺病毒的构建及其对人肿瘤细胞的影响[J];中国病毒学;1999年04期
10 郝春秋,周永兴,冯志华,李谨革,贾战生,王平忠;HCV结构基因腺病毒表达载体骨架质粒pAd.HCV-S的构建、鉴定及表达[J];医学研究生学报;2001年05期
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1 贾红梅;;腺病毒AV127株在非免疫鸭胚中增殖规律的研究[A];中国畜牧兽医学会2009学术年会论文集(下册)[C];2009年
2 谭江琳;彭旭;袁顺宗;马兵;张小容;罗高兴;吴军;;人P311腺病毒表达载体的构建及表达[A];第八届全国烧伤外科学年会论文汇编[C];2007年
3 宋智琦;;MAP_2基因转染抑制恶性黑色素瘤细胞生长的研究[A];2003中国中西医结合皮肤性病学术会议论文汇编[C];2003年
4 郑晓群;华科;彭颖;黄燕燕;杨军军;李宝青;;婴幼儿腹泻标本中腺病毒的检测及分型[A];2008年浙江省检验医学学术年会论文汇编[C];2008年
5 路秀英;杨贵贞;;应用噬菌体展示短肽探索腺病毒表位[A];第七届中国抗炎免疫药理学术会议论文摘要集[C];2000年
6 牛建强;夏咸柱;扈荣良;张守峰;黄耕;;应用细菌分子间同源重组机制快速克隆腺病毒基因组的研究[A];中国畜牧兽医学会家畜传染病学分会成立20周年庆典暨第十次学术研讨会论文集(下)[C];2003年
7 王永志;扈荣良;王莘;张守峰;李海涛;肖跃强;夏咸柱;;狂犬病病毒糖蛋白膜外区重组犬-2型腺病毒构建及免疫研究[A];人畜共患传染病防治研究新成果汇编[C];2004年
8 陈娟;方怡;付欣;李冰;张锦;冉丕鑫;;氧化抗氧化失衡对腺病毒E1A蛋白活化NF-KB转录活性的影响及机制[A];中华医学会呼吸病学年会——2011(第十二次全国呼吸病学学术会议)论文汇编[C];2011年
9 陈紫千;汤耀卿;张圣道;韩天权;毛恩强;雷若庆;;白细胞介素10腺病毒基因治疗重症急性胰腺炎的实验研究[A];中华医学会第10届全国胰腺外科学术研讨会论文汇编[C];2004年
10 郑骏年;孙方浩;李望;毛立军;刘俊杰;温儒民;孙晓青;;荷载hTERT siRNA的条件增殖型腺病毒抑制肾癌生长的体内外实验研究[A];第十五届全国泌尿外科学术会议论文集[C];2008年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 本报记者  邱曙东;上海聚焦“科技小巨人”[N];解放日报;2006年
2 新讯;“胖病毒”可能是肥胖元凶[N];医药经济报;2007年
3 ;瑞士科学家发现病毒侵入细胞的过程[N];中国高新技术产业导报;2001年
4 张建中;肥胖之因也许是病毒[N];健康报;2000年
5 徐铮奎;美国闹流感 全球打喷嚏[N];医药经济报;2008年
6 ;几种呼吸道病毒性疾病表现[N];中国医药报;2006年
7 庄北宁;神秘变异感冒病毒,在美夺10命[N];新华每日电讯;2007年
8 小文;默克公司艾滋病疫苗可能增加感染HIV风险[N];中国医药报;2007年
9 记者 陈威华;病毒侵入细胞的过程已查明[N];新华每日电讯;2001年
10 欣华;肥胖可能由病毒引起并会传染[N];医药经济报;2006年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 肖波;腺病毒介导重组人蛋白C及人神经生长因子Beta基因在兔乳腺中高效表达的研究[D];西北农林科技大学;2008年
2 韩增胜;腺病毒介导的人乳铁蛋白基因在兔和羊乳腺中高效表达的研究[D];西北农林科技大学;2006年
3 徐建国;携带人内皮抑素基因的增殖型腺病毒对结肠癌的治疗作用[D];第二军医大学;2003年
4 郭明高;表面抗体基因在肝移植中抑制乙型肝炎病毒再感染的实验研究[D];第二军医大学;2005年
5 陈雄;携带内皮抑素基因增殖型腺病毒治疗卵巢癌的实验研究[D];第二军医大学;2006年
6 王亚轩;人端粒酶逆转录酶启动子调控的单纯疱疹病毒-胸苷激酶基因重组腺病毒的构建及治疗膀胱癌的实验研究[D];河北医科大学;2005年
7 陈县城;白介素(IL)-12基因修饰间充质干细胞(MSCs)的抗肿瘤形成与抗转移研究[D];四川大学;2005年
8 苏国强;KDR启动子驱动的双自杀基因靶向治疗乳腺癌的实验研究[D];第一军医大学;2005年
9 聂明明;hTERT启动子调控的增殖型腺病毒携带内皮抑素基因治疗胃癌的实验研究[D];第二军医大学;2002年
10 李月敏;肿瘤特异性增殖腺病毒CNHK 500治疗乳腺癌的实验研究[D];中国人民解放军军事医学科学院;2004年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 李永强;P14ARF、P53基因表达与E1B-55KD缺陷型腺病毒治疗恶性肿瘤疗效关系研究[D];广西医科大学;2003年
2 孙钢;Nm23-H1cDNA片段克隆及腺病毒载体的构建[D];昆明医学院;2003年
3 李帆;重组Osterix腺病毒的构建及其对成骨细胞周期影响的初探[D];暨南大学;2006年
4 祁霞;腺病毒载体介导血管抑素对小鼠Lewis肺癌的抑制作用[D];吉林大学;2009年
5 浦昀;新型多金属氧酸盐抗甲型流感病毒药效学研究[D];吉林大学;2005年
6 张巍;CNTF基因眼内转移治疗大鼠视神经损伤的实验研究[D];第三军医大学;2005年
7 郭寿贵;人低氧诱导因子1α及其突变型重组腺病毒载体的构建[D];第一军医大学;2005年
8 周及红;莪术油眼用凝胶治疗病毒性角膜炎的药效学研究[D];吉林大学;2006年
9 李敏然;腺病毒介导HBV载体表达双靶位shRNA抑制HBV转基因小鼠体内HBV表达的研究[D];河北医科大学;2007年
10 雷锋锐;Ad-VEGF165的构建及体外转染大鼠骨髓源性血管内皮祖细胞的基础研究[D];苏州大学;2008年
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