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《西北农林科技大学》 2008年
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大花金挖耳细胞培养活性物质的研究

李玉平  
【摘要】: 大花金挖耳(Carpesium.macrocephalum Franch.et Sav)系菊科(Compositae)天名精属多年生草本植物。近代药学研究表明,该植物含有黄酮、萜内酯、甾体等多种化合物,具有清热、解毒、抗肿瘤的医疗作用和杀虫、除草及抑菌等农药活性。由于大花金挖耳生长周期长,生长受到地域和环境因素的限制,所以从大花金挖耳原植物中提取活性成分具有很大的局限性。研究利用细胞组织培养进行大花金挖耳黄酮、内酯的工业化生产是大花金挖耳研究领域的重要方向之一。 自2002年以来,笔者首次进行了大花金挖耳愈伤组织诱导及愈伤组织和悬浮细胞培养活性物质的生理生化调控的系统研究,并进行了总黄酮和內酯提取工艺的研究,同时对大花金挖耳组织、细胞培养物的生物活性进行了除草、杀菌活性的初步测试。主要内容如下: 1.诱导、筛选并建立了大花金挖耳黄酮0.72%和内酯0.056%含量(培养40d)的愈伤组织无性系RC,优化了RC培养条件,考察了RC愈伤组织无性系的生长和生物合成活性物质的动力特征。试验中以大花金挖耳无菌苗的幼根、下胚轴和子叶为外植体进行愈伤组织的诱导。结果表明:⑴大花金挖耳无菌苗的根是诱导愈伤组织的理想外植体;⑵适宜于诱导松散型愈伤组织的最适培养基是B5+ 2.0~3.0 mg/L NAA + 0.2~0.4 mg/L 6-BA,诱导率可达100%;⑶不同外植体愈伤组织的黄酮、内酯含量以根源愈伤组织最高;⑷B5+3.0 mg/L NAA +0.2 mg/L 6-BA (蔗糖45g/L、pH 5.7、25℃、12h/d)有利于愈伤组织的增殖;⑸根源愈伤组织在继代次数3~12代内黄酮和内酯含量较为稳定;⑹10 min紫外线照射可引起愈伤组织黄酮和内酯含量的提高;⑺MS、B5、NT及其组合培养基中,大花金挖耳愈伤组织生长量及黄酮、內酯产量随培养时间呈“S”型变化,其中NT培养基中愈伤组织的黄酮产量高于其他培养基中愈伤组织的黄酮产量,达9.50 mg/瓶,MS+NT培养基中愈伤组织的内酯产量高于其他培养基中愈伤组织的内酯产量,达0.72 mg/瓶。 2.构建了大花金挖耳黄酮和内酯含量分别是1.30%、0.086%(培养20d)的细胞悬浮系及其动力学模型。在愈伤组织培养的基础上,通过培养基种类、激素、生物因子、附加物等单因子及多因子优化组合对大花金挖耳细胞培养的生理、生化调控,得到生长培养基NTB:以NT培养基为基本培养基,附加1.0 mg/L NAA、0.2 mg/L 6-BA、40 g/L蔗糖,培养液pH为5.0~6.0,培养基中添加1 mg/L B3、1~2 mg/L B1,以接种量40~50 FW g/L接种于装有100 ml的250 ml三角瓶中,置于25±2℃、光照(1500~2000 Lux)12 h/d、摇床转速120 r/min等条件下继代培养。大花金挖耳细胞生长及其黄酮和内酯形成的动力学模型的模拟结果与实验测定值基本吻合,可用于大花金挖耳细胞培养过程的动力学描述。 3.初步构建了大花金挖耳细胞悬浮培养黄酮的生产培养基NTF,可得黄酮产量476.97 mg/L。通过NT培养基每个组分、附加物等单因子及多因子优化组合对大花金挖耳细胞培养的生理、生化调控,得到生产培养基NTF:大量元素NH4NO3、KNO3在NT基本培养基的基础上提高0.5倍,微量元素Na2MoO4?2H2O在NT基本培养基的基础上提高2倍,ZnSO4?7H2O、H3BO3、KI、MnSO4?4H2O、CoSO4?5H2O、CuSO4?5H2O在NT基本培养基的基础上提高1倍,附加1.0 mg/L B6,激素1.0 mg/LNAA+0.2 mg/L6-BA,其他培养条件同NTB。 4.进行了大花金挖耳细胞培养黄酮生产培养基NTF的调优研究。以基本生产培养基NTF为基础,通过附加激素、前体、诱导子、附加物等因素对大花金挖耳细胞培养的生理、生化调控,获得了显著提高黄酮含量(2.05~2.27%)和产量(516.06~551.76 mg/L)的诱导子水杨酸及硝酸银、激素KT及GA3、前体物苯丙氨酸等几个有进一步研究价值的因素。 5.进行了大花金挖耳愈伤组织、悬浮培养细胞胞内外有效成分的提取工艺研究。通过对细胞培养物的不同干燥方式、不同溶剂、不同提取方式的研究,发现大花金挖耳悬浮培养细胞的活性成分主要集中在胞内, -40℃真空冻干和60℃烘干对细胞培养物中的活性成分影响不大,培养物粉碎至40~60目,在料液比1/10~1/15的条件下,以丙酮为溶剂,摇床振荡提取1次(18 h/次)后,超声提取1次(60min/次、功率600W)即可最大量提出活性成分。 6.建立了一套大花金挖耳组织、细胞培养活性成分及营养物质消耗的化学检测方法和生物活性追踪的检测方法。通过简便的紫外—可见光分光光度法检测结合对活性物质敏感的病原菌—小麦纹枯和敏感杂草—反枝苋的活性追踪,进行大花金挖耳组织、细胞培养活性物质的生理生化调控。 7.对大花金挖耳果实、愈伤组织和悬浮细胞的化学成分进行预试,发现大花金挖耳果实中含有鞣质、内酯、香豆素、酚性成分、甾体、萜类、黄酮及其苷类、多糖及苷类、氨基酸以及挥发油类等类化学成分,与大花金挖耳果实相比,大花金挖耳愈伤组织和悬浮细胞中所含化学成分明显少于果实,主要含有黄酮、酯类、糖类、氨基酸、酚类。针对主要活性物质内酯类进行了GC-MS检测,发现愈伤组织和悬浮培养细胞中均有低含量的內酯类成分,说明大花金挖耳愈伤组织、悬浮培养细胞已经历了黄酮和内酯类化合物的次生代谢的生物合成过程,这为进一步优化调控,增加产量,直至大花金挖耳细胞培养活性物质的工业化生产成为可能。 8.初步研究了大花金挖耳细胞培养物对16种病原菌和6种杂草和3种作物种子的生物活性。发现大花金挖耳细胞培养物的工业酒精粗提物及其石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等萃取物均对供试病菌和杂草具有一定程度的活性。其中乙酸乙酯萃取物除草活性最高,对反枝苋和紫花苜蓿的EC50分别为0.2945和0.1673 mg/mL,是天明精內酯酮的0.29和0.13倍;石油醚--乙酸乙酯萃取相抑菌活性最高,在10 mg/mL时,对小麦纹枯病、番茄早疫病菌、辣椒疫霉病菌、南瓜枯萎病菌供试菌抑制率均在95%以上,EC50为0.24~3.56 mg/mL。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:S567.239

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3 张建;灰葡萄孢BC1菌株代谢产物杀菌、除草活性成分的研究[D];西北农林科技大学;2005年
4 王增蕾;细薄星芒海绵和美丽属海绵Callyspongia sp.活性成分研究[D];第二军医大学;2006年
5 杨磊;野木瓜(Stauntonia chinensis DC.)镇痛有效部位化学成分的研究[D];沈阳药科大学;2007年
6 王箐霞;大花金挖耳茎叶杀菌活性成分研究[D];西北农林科技大学;2007年
7 王琦;金银花的化学成分研究[D];沈阳药科大学;2008年
8 张涛;绞股蓝种质资源库建立及其主要活性成分的研究[D];福建农林大学;2009年
9 马菁菁;两株海洋放线菌发酵液活性成分研究[D];暨南大学;2010年
10 张保顺;灵芝发酵对夜交藤活性成分和功能的影响[D];西南大学;2006年
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