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《西北农林科技大学》 2008年
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雷公藤组织培养生产次生代谢产物及其代谢调控研究

李琰  
【摘要】: 雷公藤是一种重要的杀虫植物和传统的中药材,近年来在医用和农用无公害新型杀虫剂等方面的需求不断增加,使野生雷公藤资源盲目的开采利用而急剧减少。为保护雷公藤自然资源,维护生态环境,实现雷公藤资源可持续利用发展和满足人们的需求,通过组织培养的方式来生产雷公藤的有用次生代谢产物,具有重要的实际应用价值。本研究以雷公藤一年生枝条扦插形成的根、茎、叶为外植体诱导愈伤组织,经多次继代培养后选择疏松型愈伤组织建立悬浮细胞系和不定根培养体系,探讨外植体、培养基各种成分、培养条件、前体物质、诱导子等对悬浮细胞、不定根的生长和雷公藤内酯醇及生物碱含量的影响。主要研究结果如下: 1.雷公藤愈伤组织诱导及培养条件优化 雷公藤的外植体种类、基本培养基类型、激素浓度及组合对愈伤组织诱导有显著的影响。根、茎、叶3种外植体均可诱导出愈伤组织,6种基本培养基中MS诱导率最高;单独添加2,4-D时以1.0 mg/L诱导率最高,为47.37%;单独添加NAA时以2.0 mg/L诱导率最高,为36.32%,生长素与细胞分裂素KT或6-BA的配合使用时明显提高出愈率,最佳培养基及激素组合为MS+1.0 mg/L 2,4-D +0.5~1.0 mg/L KT,愈伤组织诱导在90%以上。 以3种不同来源的愈伤组织进行继代培养,研究愈伤组织生长与内酯醇及生物碱积累的关系,探讨基本培养基类型、激素浓度及组合、预防褐变等对愈伤组织生长及对内酯醇和生物碱含量的影响。结果表明,在连续继代多次后,根愈伤组织逐渐变的疏松、颗粒状,而茎、叶愈伤组织致密、呈块状,褐化严重。根愈伤组织增长量、内酯醇含量也明显高于茎、叶愈伤组织,而叶愈伤组织中生物碱的含量明显高于根、茎愈伤组织中的含量;7种基本培养基中6,7-V的愈伤组织增长量最大,White培养基有利于内酯醇和生物碱的积累,但愈伤组织增长量较低;不同浓度2,4-D、NAA及与KT、6-BA组合表明,1.0 mg/L 2,4-D+0.5 mg/L KT明显促进愈伤组织生长和生物碱的形成,而4.0 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA有利于愈伤组织中内酯醇的合成;培养基中加入5~10 mg/LAgNO3,不仅能明显抑制愈伤组织褐变,也明显提高内酯醇含量。暗光培养的愈伤组织增长量、内酯醇及总生物碱含量均较高,且褐化程度较轻。培养到第50天愈伤组织增长量达到最大值,第55天时内酯醇含量达到最大值,生物碱含量随着培养时间的延长而升高。 2.雷公藤悬浮培养体系的建立和优化及对内酯醇和生物碱含量的影响 以根愈伤组织建立了悬浮系,研究基本培养基类型、继代时间、接种密度、pH值和添加7种氨基酸、10种非生物诱导子和7种前体物质对细胞的生长和内酯醇和生物碱含量的影响。悬浮细胞在NT培养基的增长量最高,MS适合进一步继代培养,在White培养基上内酯醇和总生物碱的含量最高;最佳接种密度为8~12 g/L,最适继代时间为30~35 d,培养55天时收获细胞。培养液pH值为5.8时,细胞增长量最大,内酯醇在pH值为6.4时最高,pH值为5.2时总生物碱最高。 培养基中天冬氨酸、酪氨酸、精氨酸和丝氨酸的加入明显抑制雷公藤细胞的生长,且浓度越大抑制作用越强;加入苯丙氨酸、蛋氨酸和半胱氨酸等在低浓度时能促进细胞的生长。7种氨基酸均能不同程度的促进内酯醇的合成,其中精氨酸1mmol/L和半胱氨酸2 mmol/L时,内酯醇含量较对照提高了3.2倍和2.8倍。除半胱氨酸明显抑制生物碱的合成以外,其他氨基酸的加入对雷公藤生物碱的合成均起不同程度的促进作用,其中蛋氨酸0.5 mmol/L时,雷公藤不仅生物碱含量较对照提高了1.5倍,内酯醇含量也较对照提高了2.3倍。 非生物诱导子中,大豆蛋白、水杨酸、水解酪蛋白、谷氨酰胺、酸水解干酪素和甲醛抑制细胞的生长,矮壮素、乙酸钠、酵母提取物和苯甲酸钠在低浓度时对细胞的生长起促进作用。除酸水解干酪素抑制内酯醇的合成以外,其他均对内酯醇的合成起促进作用,其中谷氨酰胺2 mmol/L和大豆蛋白1 g/L时,内酯醇含量较对照提高了2.4倍和2.9倍。除水杨酸明显抑制生物碱的合成以外,其他诱导子的加入对雷公藤生物碱的合成均起促进作用,其中酵母提取物2 g/L时,雷公藤生物碱含量较对照提高了1.3倍。甲醛浓度为1.0 mL/L时,虽然细胞增长量仅为对照的77%,但内酯醇含量为对照的2倍,总生物碱含量为对照的1.2倍。 前体物质中,除桂皮酸对雷公藤细胞的生长起抑制作用外,其他前体物质在低浓度时对细胞的生长起促进作用。除丙二酸抑制内酯醇的合成以外,其他前体物均对内酯醇的合成起促进作用,其中桂皮酸10 mg/L时,较对照提高了2倍;异戊二烯10 mL/L内酯醇为对照的2.5倍,总生物碱含量为对照的1.5倍,而细胞的增长量下降并不明显,为对照的96%。柠檬酸、桂皮酸和丙酮酸对雷公藤生物碱的合成起抑制作用,丙二酸、苹果酸和酒石酸在低浓度时对雷公藤生物碱的合成起促进作用,其中丙二酸浓度为2.0 mmol/L细胞内总生物碱含量为对照的2倍。 3.雷公藤不定根培养体系的建立和优化及对内酯醇和生物碱含量的影响以悬浮细胞诱导不定根,建立不定根摇瓶培养体系,研究培养液中营养元素的消耗规律,探讨大量元素、微量元素、碳源及有机物和生物诱导子等对不定根生长和内酯醇及生物碱含量的影响。在悬浮细胞中,加入4.0 mg/L NAA,可诱导产生不定根,经过多代培养,形成了稳定的雷公藤不定根培养体系,检测不定根中内酯醇含量为悬浮细胞的2.1倍,为根皮粉中的4.5倍。 经对NT培养基中大量元素的消耗动态研究,不定根进入快速生长期后,氮、磷、钾元素含量明显不足导致生长进入停滞期;当NO3-/NH4+与NT培养基一致并维持不变时,随着培养基中氮浓度的提高,雷公藤不定根增长量急剧上升,当总氮浓度为50 mmol/L时,增长量达到最大值。当总氮浓度为30 mmol/L时,内酯醇和总生物碱含量达最大值。在NO3-/NH4+为9︰1时,不定根增长量最大,内酯醇含量与NT培养基氮源比例基本一致时最高;只有铵态氮的情况下,不定根中总生物碱的含量为最高。不定根增长量随着PO43-、K+、Ca~(2+)和Mg~(2+)浓度的升高而升高;内酯醇含量在K+浓度为NT培养基的1.3倍时,Ca~(2+)浓度为NT培养基的2/3时,达到最大值,内酯醇含量随着PO43-浓度的升高而升高,NT培养基中Mg~(2+)浓度即可使内酯醇含量达到最大值;NT培养基中PO43-、K+、Ca~(2+)和Mg~(2+)浓度即可使总生物碱含量达到最大值。 微量元素中,NT培养基中Fe~(2+)、Zn~(2+)和Cu~(2+)即可满足雷公藤不定根的生长,2倍Mn~(2+)浓度可使雷公藤不定根的生长量达最大值,在试验范围内,Na2MoO4浓度越高不定根增长量越高,培养基中缺乏H3BO3、KI和CoCI2不影响雷公藤不定根的生长;Fe~(2+)浓度为正常标准的1/3时,内酯醇和总生物碱的积累达到最大值;在试验范围内内酯醇和总生物碱的含量随Mn~(2+)浓度的升高而升高;Zn~(2+)盐浓度的2倍可使内酯醇的积累达到最大值,而生物碱的积累在该试验范围内随着Zn~(2+)盐浓度的升高而升高;Cu~(2+)盐浓度的2倍可使内酯醇和生物碱的积累达到最大值;H3BO3的加入对内酯醇及总生物碱的合成起抑制作用,浓度越高抑制作用越强;培养基中缺乏KI时不影响生物碱的合成,内酯醇的含量随着KI浓度的升高而升高;培养基中缺乏CoCI2并不影响内酯醇的合成,在NT培养基正常标准的2倍时,生物碱的含量最高;培养基中缺乏Na2MoO4有利于不定根中内酯醇和生物碱的合成,不定根中内酯醇和生物碱的含量随着鉬酸钠浓度的升高而降低。 碳源中,适合不定根生长、内酯醇形成的碳源为蔗糖,适合生物碱积累的碳源为葡萄糖;适合雷公藤不定根生长的蔗糖浓度为45 g/L,不定根中内酯醇和生物碱含量在蔗糖浓度为20 g/L时最高。7种有机物中,NT培养基中的正常标准的肌醇和VB1,即可使雷公藤不定根增长量、内酯醇及生物碱含量达到最大值。加入0.5 mg/L的烟酸可使内酯醇的含量达到最大值,但烟酸的加入对不定根中生物碱的合成明显的抑制作用,且浓度越高抑制作用越强。当VB6浓度为1mg/L,不定根增长量、内酯醇及生物碱含量达到最大值。在试验范围内,不定根增长量、内酯醇含量随着甘氨酸浓度的增加而升高,生物碱含量在甘氨酸浓度为1 mg/L时,达到最大值。叶酸和生物素的加入并不影响雷公藤不定根的生长,但在叶酸浓度为1 mg/L时,可使内酯醇及生物碱的含量达到最大值。生物素在0.5 mg/L时,内酯醇含量达到最大值,在1 mg/L时,生物碱的含量达到最大值。 采用7种生物诱导子分别处理雷公藤不定根,均能促进不定根中内酯醇和生物碱的合成,并且对不定根的生长均没有明显影响,其中链霉菌和苹果炭疽病菌效果最好。经苹果炭疽病菌处理的雷公藤不定根中内酯醇的含量达88.65μg/gDW,为对照(39.62μg/gDW)的2.2倍,生物碱含量达6.09 mg/g DW,为对照(3.02 mg/gDW)的2倍。诱导子的作用效果与诱导子浓度、诱导子作用时间及不定根的生长状态有关。对苹果炭疽病菌来说,诱导子作用的最适浓度为每毫升培养基含糖100μg/mL;不定根在对数生长末期对诱导作用最敏感;在加入诱导子15 d后收获不定根,不定根中的内酯醇含量最高,而生物碱含量随诱导子作用时间的延长而提高。 在不同体积的三角瓶中,按三角瓶体积的2/5加入培养液,随着三角瓶体积的增大,雷公藤不定根增长量略有下降, 1 L和5 L的三角瓶中不定根增长量分别下降2.92%和6.57%,而不定根和培养液中的内酯醇及生物碱含量差异不明显。内酯醇和生物碱均为分泌型,在过滤不定根后的培养液中内酯醇占每瓶内酯醇总量的56%,总生物碱占每瓶总量的65%。 4.雷公藤组培产物有效成分含量测定及杀虫活性研究 建立了在同一提取物中同时测定雷公藤内酯醇和总生物碱的方法。内酯醇的检测范围为1~100μg/ mL,(R2= 0.9999);雷公藤总生物碱在5-100μg/ mL范围内线性关系较好(R2= 0.9998);在同一提取液中,雷公藤内酯醇和总生物碱的加样回收率分别为100.72%(RSD=0.975%)、100.33%(RSD=2.56%)。不同组织培养产物提取液对3龄小菜蛾的生长均有明显的抑制和毒杀作用,其中不定根培养物提取物处理后每天的小菜蛾体重增加量均成了负值,72 h后70%左右已经死亡,存活的试虫体重比试验前下降了18.33%。 5.雷公藤再生体系建立及组培快繁研究 以雷公藤胚性愈伤组织为材料,研究了体细胞胚的发生过程和植株再生、芽苗增殖的影响因素。组织学观察表明,雷公藤体细胞胚起源于愈伤组织内部的单细胞,发育历程与合子胚相似。在愈伤组织再生中,NAA较2,4-D效果好, 6-BA优于KT,NAA与6-BA配合使用明显提高再生率。6种培养基中,MS和B5的愈伤组织再生率达100%,在0.1 mg/L NAA+1.0 mg/L 6-BA的MS培养基上,不仅愈伤组织再生率达100%,而且每块愈伤组织平均形成芽数也比较多。胚性愈伤组织在继代培养过程中,植株再生率和愈伤组织分化形成的小苗数,经历了一个由低到高再到低的过程。以继代八个月到一年之间的胚性愈伤组织的再生能力最强,达100%。雷公藤胚性愈伤组织在继代20个月后已经丧失分化能力。再生苗茎段增殖以1/2MS+2.0 mg/L IBA为好,生根培养以1/2MS+2.0 mg/L IBA+0.5 g/L活性炭较好,生根率达100%。移栽至珍珠岩与腐殖质土(1︰1)的混合基质中成活率达96%。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:S567.239

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9 殷培军;植物源抗病毒剂VFB抗烟草花叶病毒(TMV)活性研究[D];西北农林科技大学;2005年
10 高勇;胰岛素信号通路中GLUT4的作用机制研究[D];浙江大学;2006年
【二级引证文献】
中国期刊全文数据库 前5条
1 邬树伟;吕晓玲;郝磊;魏曼;赵京;;紫苏迷迭香酸合成酶基因片段克隆及表达[J];广东农业科学;2012年20期
2 万晓琦;宋萍;封磊;洪伟;吴承祯;葛恒懿;;雷公藤细胞的固定化研究[J];福建林学院学报;2013年03期
3 郭春梅;尹忠平;上官新晨;陈继光;付晓;;硝普钠对青钱柳悬浮细胞三萜合成的影响[J];现代食品科技;2014年04期
4 尹忠平;上官新晨;陈继光;吴少福;黎冬明;;青钱柳悬浮培养细胞三萜酸的分离及结构鉴定[J];林业科学;2013年09期
5 谷荣辉;洪利亚;龙春林;;植物细胞培养生产次生代谢物的途径[J];植物生理学报;2013年09期
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 王娟;人参、西洋参和甘草组织培养研究[D];天津大学;2012年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 杨艳;茉莉酸甲酯处理雷公藤悬浮细胞的基因差异表达分析[D];西北农林科技大学;2011年
2 李婷;孜然杀菌剂的环境安全性评价[D];西北农林科技大学;2012年
3 于传;美国红枫(Acer rubrum)的组织培养技术体系研究[D];西南大学;2013年
4 郭紫娟;白背三七细胞悬浮培养体系的建立及主要成分分析[D];江西农业大学;2013年
5 李彦;光照和种源对青钱柳叶三萜类化合物积累的影响[D];南京林业大学;2013年
6 冯慧娜;雷公藤发状根的鉴定和培养及其次生代谢物调控初步研究[D];西北农林科技大学;2013年
7 颜秉佳;链霉菌ZX01菌株次生代谢物抗烟草花叶病毒(TMV)活性成分初步研究[D];西北农林科技大学;2013年
8 刘艳;紫苏愈伤组织诱导与成分分析[D];中北大学;2014年
9 李树燕;不结球白菜雄蕊瓣化系与保持系的差异分析[D];南京农业大学;2013年
10 刘超;雷公藤人工林林下植被群落生态及凋落物持水性研究[D];福建农林大学;2014年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 韩书亮;大苞雪莲四种成分抗癌作用研究[J];癌变.畸变.突变;1995年02期
2 范志强,杜希华,蹇兆忠,李景涛,解孝满;辣椒组织培养中褐变问题的研究[J];山东农业科学;2000年06期
3 胡蕙露,胡翠玲,杨枝发;银杏茎段组织培养正交试验[J];安徽农业大学学报;1997年02期
4 虞海燕,秦万章;雷公藤活性单体的筛选及毒性研究[J];浙江中医学院学报;2000年02期
5 魏益宁;毛白杨叶片受马格栅锈菌侵染以后多酚氧化酶和过氧化物酶活性及同功酶谱带变化趋势的研究[J];北京林学院学报;1984年03期
6 陈耀华,董鹏举,白恒勤;银杏组培育苗试验初报[J];北京林业大学学报;1988年S2期
7 郭素娟,凌宏勤,李凤兰;白皮松插穗生根的生理生化基础研究[J];北京林业大学学报;2004年02期
8 张永红,王莲英;-安祖花生长发育特性初探[J];北京林业大学学报;1995年02期
9 朱青松,梅康凤,王沙生;外源生长素对烟草髓愈伤组织分化和内源IAA含量的影响[J];北京林业大学学报;1999年01期
10 罗晓芳,田砚亭,姚洪军;组织培养过程中PPO活性和总酚含量的研究[J];北京林业大学学报;1999年01期
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 王秀红;水稻不同外植体的组织培养能力及其内源激素分析[D];四川农业大学;2002年
【相似文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 陈道明 ,黄敏仁;加龙杨(Poqulus nigra cv.Blanc de garonne)茎尖组织培养及其同工酶的变化[J];南京林业大学学报(自然科学版);1980年03期
2 郭达初;林证明;;泡桐、红杉和巨杉的器官培养与发生的初步试验[J];林业科学;1981年04期
3 谭绍满;;插条育苗的几个重要问题[J];广东园林;1982年03期
4 孙国凤;;日本农林水产省和种苗协会开发利用愈伤组织和细胞培养的育种技术[J];生物技术通报;1987年11期
5 王俊丽,杜建芳,耿钰;杜仲愈伤组织培养研究[J];经济林研究;1996年04期
6 陈雄庭,江梅;钙对橡胶愈伤组织脆性和体细胞胚发生的效应[J];世界热带农业信息;1996年08期
7 刘贤旺,杜勤,罗光明,姚振生,赖学文,徐志杰,刘勇,葛菲;半枫荷愈伤组织超低温保存研究初报[J];中药材;1996年07期
8 张海,易永华,左田夫,邢宏宜;提高棉花花药愈伤组织诱导率的研究[J];西北农业学报;1998年03期
9 周丽艳,高书国,杨文利,王翠花;甘薯愈伤组织的诱导[J];河北职业技术师范学院学报;2002年04期
10 施和平,权宏;紫花洋地黄的组织培养和植株再生[J];中草药;2004年03期
中国重要会议论文全文数据库 前10条
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2 曾小美;王凌健;夏镇澳;沈允钢;;烟草光自养型愈伤组织的光合特性研究[A];中国植物生理学会全国学术年会暨成立40周年庆祝大会学术论文摘要汇编[C];2003年
3 翟晓巧;;二乔刺槐愈伤组织超低温保存研究[A];第六届全国林木遗传育种大会论文集[C];2008年
4 朱向涛;王雁;彭镇华;律春燕;郑宝强;;牡丹愈伤组织扫描电镜观察[A];中国观赏园艺研究进展(2010)[C];2010年
5 孙震晓;刘传召;郭善利;马清温;;植物愈伤组织超低温保存的实验研究[A];第七届全国系统与进化植物学青年学术研讨会论文摘要集[C];2002年
6 周安莲;余茂德;;桑子叶愈伤组织的诱导培养[A];中国蚕学会第三届青年学术研讨会暨浙江省第二届青年学术论坛——蚕桑分论坛论文集(上册)[C];2001年
7 许鸿源;蒙爱东;李春霞;邓锡青;杨美纯;周歧伟;黄春燕;许鸿章;;灵发素(LFS)对三七愈伤组织发生和增殖的影响[A];2003年广西植物生理学年会论文汇编[C];2003年
8 佘建明;张保龙;陈志一;倪万潮;;草坪型高羊茅成熟种子离体培养植株再生技术研究[A];全国作物细胞工程与分子技术育种学术研讨会论文集[C];2003年
9 许明淑;黄璐琦;;贯叶金丝桃愈伤组织的诱导研究[A];全国中药研究与开发学术研讨会论文摘要集[C];2001年
10 乔亚科;李桂兰;高书国;毕艳娟;;野生大豆愈伤组织与苗期耐盐力的相关性[A];中国青年农业科学学术年报[C];2002年
中国重要报纸全文数据库 前10条
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2 唐山市丰南区林业局 汪林华 魏文娟 贾久正;这是杨树破腹病[N];河北科技报;2006年
3 濮阳市世锦现代农业发展有限公司 张晖 王绪月;花卉无性系的快速繁殖[N];中国花卉报;2006年
4 容城县农牧局 赵会芳 容城县八于乡农技服务站 沈山林;大棚西瓜嫁接育苗十注意[N];河北科技报;2007年
5 曹涤环 刘建武;影响苗木嫁接成活的因素[N];中国绿色时报;2008年
6 山东 吴建民 田俊华;硫磺在花木栽培上的妙用[N];中国花卉报;2005年
7 河南省三门峡市园林科学研究所 许冬丽 高秀云 李艳杰;春植树木夏亡原因及防范[N];中国花卉报;2010年
8 青县职教中心 刘恩祥;枣树蘸蜡插皮接效果好[N];河北科技报;2006年
9 山东 吴建民 田俊华;草木灰的应用[N];中国花卉报;2005年
10 正定县林业局 安建会;枣树开甲后不愈合的补救措施[N];河北科技报;2007年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 吴顺;籼稻成熟胚再生体系的建立及反义waxy基因转化籼稻的研究[D];湖南农业大学;2005年
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8 秦磊;牡丹分生结节诱导、发生与发育及细胞组织学观察[D];北京林业大学;2012年
9 姚娜;竹子组织培养与毛竹愈伤组织分化中基因表达分析[D];中国林业科学研究院;2010年
10 耿小丽;苜蓿单倍体、纯合四倍体的诱导及愈伤组织DNA含量变异的研究[D];甘肃农业大学;2010年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 王惠珍;穗冠花愈伤组织的诱导和花色素苷积累的研究[D];华南师范大学;2002年
2 张清梅;中小型苹果再生体系的研究[D];内蒙古农业大学;2005年
3 高兵;不同培养条件对嘎拉苹果愈伤组织遗传变异的影响研究[D];南京农业大学;2005年
4 赵莉;不同营养条件对大苞景天愈伤组织诱导及植株再生的影响研究[D];四川农业大学;2005年
5 刘晓光;枣愈伤组织诱导和原生质体分离研究[D];河北农业大学;2006年
6 王辉;香榧的组织培养及快繁技术的研究[D];浙江大学;2006年
7 赵世萍;蝴蝶兰组织培养过程中特异蛋白表达差异的研究[D];东北师范大学;2006年
8 胡楠;魔芋浅层液体组织培养及多倍体诱导研究[D];西南大学;2011年
9 袁秀平;红王子锦带组培再生植株体系的研究[D];西北农林科技大学;2004年
10 宁强;枣愈伤组织的诱导及多倍体诱变研究[D];河北农业大学;2006年
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