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《西北农林科技大学》 2008年
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猪胰腺干细胞分离鉴定

王赟  
【摘要】: 糖尿病是全球性医学难题,目前,对糖尿病的治疗虽然有很多方法,但都不能从根本上解决问题。主要受制于供体不足和免疫排斥的问题。因此,人们寄希望于干细胞替代疗法。干细胞增殖力强、数量充足、移植排斥反应相对较低,更重要的是胰腺干细胞可塑性强,可以分化形成胰腺组织的各种细胞。猪胰腺干细胞的研究,目的在于解决干细胞来源的问题. 本人在实验室以往的工作基础上,进一步分离、鉴定猪胰腺干细胞。无菌采集胎猪胰腺120例,采用酶消化法,用RPMI1640加入1mmol/L丙酮酸钠,71.5μmol/Lβ-巯基乙醇,20ng/mL EGF、20ng/mL bFGF,100U/mL青霉素100U/mL、链霉素0.1mg/mL,添加10% FBS作培养基培养细胞。结果有59例仅获得原代细胞,部分传至6~8代后,细胞大量飘浮死亡。同时观察到细胞传至6~8代时,随着细胞的大量死亡漂浮,皿底始终零散地保留一些圆形的、折光性强的小细胞。此时采用含20%血清的上述培养液后,皿中的小细胞在换液24h后形态发生变化,变大、变长,迅速扩增。48h后,每个小圆细胞形成一个克隆,96h后形成大的克隆,直径超过100um,随后细胞不断从集落边缘迁徙出来,细胞间相互连接,形成网络状生长,5~6天就会融汇成单层,此类细胞可以多次进行传代。由此发现胰腺干细胞不能传过7~8代的制约因素,成功地突破了胰腺干细胞扩增难题,并且一次获得4株胰腺干细胞,其中一株已经顺利传至64代,另3例传至10代,各代均有冻存;在诱导分化实验中观察到如果用无血清的培养基诱导胰腺干细胞向β细胞分化,细胞可以大量形成胰岛细胞团,但是成团后细胞活力很快下降,发黑、漂浮甚至死亡。因此,进一步探索了诱导条件,采用含血清的诱导液诱导,不仅可以促使胰腺干细胞向胰岛内分泌细胞分化,而且有效地避免了细胞分化后活力下降的问题。利用高糖刺激胰岛素释放实验,胰岛素和c-肽的分泌量分别可以达到306.87±20.72 mIU/mL和0.31±0.11ng/mL。 经免疫组化检测,细胞表达目前公认的胰腺干细胞特异性标记物,如胰肠同源域因子1、葡萄糖转运子2、巢蛋白和波形蛋白,经RT-PCR检测,细胞表达胰肠同源域因子1、葡萄糖转运子2、胰淀素前体、胰岛素、生长抑素,确定分离获得的细胞为胰腺干细胞。细胞经成骨细胞诱导液诱导后,有明显的细胞聚集成团块状物的形成,经茜素红染色呈阳性;向神经细胞诱导后,细胞NF-200染色阳性;细胞亦表达胚胎干细胞的一些标志,如强表达胚胎干细胞的表面标志物OCT-4、胚胎阶段特异性抗原(1Stage-specific embryonic antigens SSEA-1);用流式细胞仪证实细胞表达骨髓间充质干细胞的一些表面标志,如CD29,CD44,CD166。通过裸鼠致瘤性实验证实所分离的胰腺干细胞无致瘤性。并制备了大鼠糖尿病模型,将诱导后的细胞经腹腔注射给大鼠模型用于治疗,仅在注射后的2~4天内,血糖略有下降。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:Q813

【参考文献】
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