稳定表达牛Nanog基因的成纤维细胞制作、多能性分析及转基因克隆胚胎构建

【摘要】： ES细胞具有自我更新和多向分化潜能,是遗传操作、发育生物学和疾病模型极具价值的研究工具。家畜的ES细胞建系可用于人类遗传疾病模型制作和细胞移植治疗;还可应用于旨在改进家畜自身的生产性能,进而提高畜产品的质量的畜种改良、抗病育种和生物制药这些应用研究领域。尽管在二十多年前就建立了小鼠的ES细胞系,在二十世纪九十年代建立了灵长类ES细胞系,但目前还没有建立真正的家畜ES细胞系。本研究通过遗传修饰的方法,将维持ES细胞多能性的转录因子导入牛皮肤成纤维细胞,获得稳定转染的细胞株,再用这些转基因的供核细胞构建克隆胚胎,试图为家畜ES细胞建系开辟一条新途径。经过试验,取得了以下研究成果。 (1)本研究通过RT-PCR方法从胎牛原始生殖嵴总RNA中扩增、克隆了牛Nanog基因全长cDNA,序列分析表明该段基因由903个核苷酸碱基组成,与牛Nanog编码序列进行BLAST联配分析,同源性为99.9%,只有第170位碱基发生了错义突变(T→C),第58位编码氨基酸由苏氨酸(Thr)变为异亮氨酸(Ile)。 (2)成功构建了pGEX-KG-Nanog原核表达重组质粒,转化大肠杆菌JM109, IPTG诱导表达后,获得了约60KD的表达产物,表达产物的分子量大小与预期的GST-Nanog融合蛋白大小相符; Western blotting免疫印迹试验表明表达产物可以与GST抗体发生特异性结合,表明表达的目的蛋白具有反应原性。为制备牛Nanog多克隆抗体奠定了基础。 (3)成功构建了pEGFP-Nanog、pFLAG-Nanog真核表达重组质粒,在脂质体介导下转染皮肤成纤维细胞,并经G418筛选,分别获得了3株和1株稳定转染的细胞株。 (4)稳定转染的细胞经RT-PCR检测均表达Nanog mRNA;经western blotting检测,表达EGFP-Nanog融合蛋白(60KD)的和FLAG-Nanog(34KD)融合蛋白,表明牛Nanog基因在皮肤成纤维细胞中成功表达。 (5)稳定表达FLAG-Nanog和EGFP-Nanog的细胞株,经免疫染色鉴定,除了表达Nanog外,还表达Oct-4和胚胎干细胞表面抗原SSEA-4。 (6)流式细胞仪检测干细胞表面标志发现,表达FLAG-Nanog的成纤维细胞其CD71、CD29和CD11a阳性率比未转染的成纤维细胞分别高67%、2.5%和7%。 (7)经悬浮培养,表达FLAG-Nanog的成纤维细胞能形成典型的类胚体,RT-PCR检测发现这些类胚体表达三个胚层细胞的分化标志基因。 (8)多能性检测试验数据表明,稳定表达Nanog基因的细胞具有一定的多能性。 (9)核移植试验发现,未转染Nanog基因的成纤维细胞(BEF422)构建的克隆胚胎卵裂率(82.14%)远远高于转基因的克隆胚(40.38%和52.94.0%)(p0.05),差异显著,但前者的囊胚率(14.29%)与后两者(12.82%和11.76%)接近(p0.05),差异不显著。说明表达多能性转录因子Nanog的成纤维细胞与未经遗传修饰成纤维细胞所构建的克隆胚胎卵裂后具有同样的发育潜能。