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《西北农林科技大学》 2008年
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山羊角膜上皮细胞与角膜内皮细胞分离培养研究

赵清梅  
【摘要】: 各种角膜疾病和外科损伤都会导致角膜细胞受损,当损伤超过其生理代偿时,就会发生角膜病变,严重时会导致角膜盲。目前角膜移植是治疗此类角膜疾病比较成熟的方法,但受到了供体角膜缺乏、术后并发症、角膜供体老龄化等条件的限制。将自体或异体角膜细胞体外培养构建组织工程化人工角膜移植,既可解决临床应用供体短缺问题,又可为角膜体外药理或生理研究提供大量材料。本研究通过体外分离培养山羊角膜上皮细胞和角膜内皮细胞,并研究其体外生长特性和接种羊膜载体培养情况,为组织工程人工角膜的构建奠定理论基础。 1.山羊角膜上皮细胞的体外分离培养与鉴定 通过比较组织块和酶消化法培养山羊原代角膜缘上皮细胞,发现酶消化法更适合原代角膜缘上皮细胞的分离纯化培养。获取的山羊角膜缘上皮细胞形态为多角形,具有较强的增殖能力,体外培养能传20多代,细胞冻存后仍具有细胞冻存前的形态和活力。经免疫组化和RT-PCR检测,培养的角膜缘上皮细胞表达K3/K12、p63、Cx43、ABCG2和PCNA,具有角膜上皮细胞和角膜缘干细胞表型,说明分离培养的细胞为角膜缘上皮细胞和角膜缘干细胞混合物,可为组织工程化人工角膜上皮的构建提供种子细胞。 2.组织工程化人工角膜上皮的构建 在去上皮细胞人羊膜上接种关中奶山羊角膜缘组织块或培养的关中奶山羊角膜缘上皮细胞构建的组织工程角膜上皮,并对其进行组织形态学、超微结构观察和免疫组化检测。结果显示,角膜缘组织块和角膜上皮细胞在羊膜上培养15 d均可形成6~7层结构,细胞内含丰富的细胞器和糖原颗粒,细胞间有大量的桥粒连接,细胞与羊膜间形成半桥粒连接,构建的复合角膜上皮p63染色阳性。比较角膜缘组织块在去羊膜上皮细胞的新鲜羊膜、冻存30 d羊膜、冻存60 d羊膜和冻存180 d羊膜上生长情况发现,从角膜缘组织块脱出的细胞生长面积在冻存30 d羊膜上最大,而在新鲜羊膜上细胞生长面积最小。比较角膜缘组织块在冻存60 d去上皮羊膜和未去上皮羊膜上生长情况发现,从角膜缘组织块脱出的细胞生长面积在去上皮羊膜上显著大于未去上皮羊膜上。说明用组织块法和种传代细胞法均能构建组织工程化人工角膜上皮,细胞培养载体需用冻存30 d左右去上皮细胞的羊膜,为组织工程化人工角膜上皮的构建研究奠定理论基础。 3.山羊角膜内皮细胞的体外分离培养与鉴定 比较组织块法、胰酶消化法、dispase酶消化法和dispase酶+胰酶消化法培养山羊原代角膜内皮细胞。dispase酶+胰酶消化法为角膜内皮细胞原代分离纯化的最适方法,分离的细胞在体外能连续传20多代,细胞冻存后解冻培养能保持冻存前细胞形态和活力。培养的细胞经扫描电镜和透射电镜观察,具有正常角膜内皮细胞特征,免疫组化染色和RT-PCR检测角膜内皮细胞表达神经元标志NSE和β3-tublin、星形胶质细胞标志GFAP、细胞间连接蛋白ZO-1和Cx43,不表达神经干细胞标志物Nestin、角膜缘干细胞标志p63和角膜上皮细胞标志K3/K12。比较细胞培养板包被物对角膜内皮细胞贴壁和增殖能力影响发现,Ⅳ胶原、多聚赖氨酸和明胶均能明显促进细胞贴壁和增殖,Ⅳ胶原和明胶组强于多聚赖氨酸组,而Ⅳ胶原组和明胶组之间差异不显著,提示可选择价格便宜的明胶作为细胞培养板用包被物。角膜内皮细胞培养液筛选发现:与NBS相比,FBS能更好的促进角膜内皮细胞增殖和维持其形态;培养液中添加bFGF能显著促进细胞增殖,但能促进细胞形态向成纤维形转变;添加EGF对细胞增殖影响不大,但能促进细胞形态改变;添加硫酸软骨素显著抑制细胞增殖,但能较好的维持细胞形态;添加Vc对细胞增殖和形态均无明显影响。将传代培养的角膜内皮细胞种羊膜上培养,经组织切片、透射和扫描电镜观察发现细胞在羊膜上具有形成单层的能力。说明分离培养的角膜内皮细胞具有正常角膜内皮细胞特征,能体外传代培养,在羊膜载体上具有形成单层的能力,可为构建组织工程化人工角膜内皮和角膜内皮细胞的体外实验研究提供种子细胞。 4.山羊角膜内皮细胞人端粒酶逆转录酶基因转染 将人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)转入培养至7代的角膜内皮细胞内,通过免疫组化和RT-PCR检测证明转染的hTERT在山羊角膜内皮细胞内表达。通过传代培养观察,转染hTERT的角膜内皮细胞体外能传20多代,与未转染hTERT的角膜内皮细胞相比,并未显著提高其增殖能力。说明将人端粒酶基因转入山羊角膜内皮细胞内,未能明显延长细胞寿命。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:Q813

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