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《西北农林科技大学》 2008年
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猪圆环病毒2型(PCV2)的研究

祝卫国  
【摘要】: 猪圆环病毒2型(PCV2)是断奶仔猪多系统衰竭综合征(PWMS)的主要病原,是一种新发现的病毒,它不但可以引起断奶仔猪发生衰竭、死亡,还与仔猪A2型先天性震颤(AII,CT)、怀孕母猪流产、成年猪皮炎肾炎综合征(PDNS)和呼吸道疾病综合征(PRDS)有关。这些疾病的广泛流行严重影响了养猪业的发展,给许多国家和地区带来巨大的损失。更为严重的是PCV2的感染可以造成免疫抑制,引起其他各种病原的继发感染,造成的间接损失难以估计。目前,PCV2已经成为严重阻碍我国养猪业发展的主要病原之一。为了调查确证陕西省是否受到该病的感染,为我国诊断、防制与研究该病提供科学依据和技术手段,笔者进行了陕西省猪圆环病毒2型的研究,取得以下结果: 1.陕西省PMWS感染的血清学调查。通过对陕西省多个不同地区的规模化养猪场的PCV2抗体进行检测,结果表明:陕西省该病的平均阳性率为35.9%(171/476);在不同生长阶段的猪群中,未断奶仔猪阳性率2.3%(2/88),断奶仔猪阳性率为48.8%(41/84),肥育猪阳性率为49.4%(39/79);种公猪阳性率为16.1%(5/31),后备母猪阳性率为16.9%(20/118),经产母猪阳性率为57.5%(69/120)。不同地区PCV2感染的程度具有一定的差异,阳性率从20%到65%不等。从血清学方面确证陕西省养猪业已经受到PCV2的感染。 2.PCV2 SX株的分离。根据GenBank中猪圆环病毒1型和2型的序列,设计2对套式PCR引物,160头疑死于PMWS的仔猪组织病料提取DNA,进行套式PCR扩增,检测到了87份PCV2阳性病料。取其中3份病料接种PK-15细胞传代培养,提取第10代和20代细胞培养物中的DNA做PCR鉴定,获得了PCV2陕西分离株。从病原学方面证明PCV2已经在陕西省广泛流行。 3.PCV2 ORF2基因的克隆及其序列分析。根据GenBank中PCV2 ORF2基因序列设计一对引物,在引物P1中引入KpnI酶切位点,引物P2中引入HindⅢ酶切位点。从PCV2陕西分离株细胞培养物中扩增ORF2基因(702 bp),并克隆入pMD18-T载体,经PCR、酶切、测序鉴定,筛选出重组质粒pMD-ORF2。对测序结果用DNAStar软件分析并与GenBank上发表的其他序列进行比对,绘制遗传进化树。结果表明,所克隆的ORF2基因与DB分离株核苷酸序列同源性最高为99.7%,与其它PCV2的ORF2核苷酸序列同源性在90.6%~99.7%之间,推导的氨基酸序列同源性在90.9%~99.6%之间。说明PCV2陕西分离株未发生明显的变异。 4.PCV2抗体检测间接ELISA方法的建立。根据GenBank中PCV2 ORF2基因序列设计一对引物,应用PCR扩增PCV2 ORF2基因的3’端约600 bp。该PCV2 ORF2基因已去除终止子,并在其上下游添加Kpn I和Hind III酶切位点。PCR产物用Kpn I和Hind III酶切后与经同样处理过的pBAD/gIIIB Vector连接,转化TOP10细胞后挑取阳性克隆,经酶切鉴定和测序验证后用L-arabinose诱导进行融合表达,表达的蛋白主要以包涵体存在。经过镍离子亲和层析柱纯化,SDS-PAGE显示一条约28 ku的目的条带,纯度达到85%以上。以该28 ku的多肽包被酶标板,建立了检测PCV2抗体的间接ELISA方法。用该方法对陕西关中和陕北多个养猪场的160份血清进行了检测,其结果与用华中农业大学猪圆环病毒2型ELISA检测试剂盒检测的结果一致。 5.PCV2 ORF1、ORF2串联基因重组腺病毒的构建及其表达。扩增PCV2的ORF1和ORF2基因,串联克隆入pMD18-T载体后亚克隆入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,阳性穿梭质粒经Pme I酶线性化后与骨架载体pAdeasy-1在细菌BJ5183内完成重组,获得重组腺病毒质粒。重组腺病毒质粒用Pac I酶线性化后转染293细胞,包装成重组腺病毒,然后从致细胞病变、荧光检测及PCR检测等方面对该重组腺病毒进行了鉴定。以该重组腺病毒免疫小鼠,对免疫鼠血清中PCV2的特异性抗体进行了检测。结果证实成功构建的含有PCV2 ORF1和ORF2基因的重组腺病毒,可诱导机体产生PCV2的特异性抗体,为PCV2活载体基因工程疫苗的研制提供了理论依据。 6.猪圆环病毒2型(PCV2) DNA疫苗的研究。根据核定位信号肽MPG的氨基酸序列,并结合PCV2的密码子偏爱性设计引物,PCR扩增出MPG-ORF2基因,并将其克隆入腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中构建pAdTrack-CMV-MGP-ORF2质粒。用构建的pAdTrack-CMV-MGP-ORF2做模版,两次PCR扩增获得pcr CMV-MPG-ORF2-SV40end ,将其构建入Pmd18-T载体,即获得了Pmd18-T-CMV-MPG-ORF2-SV40end DNA疫苗。用人工合成的MPG肽和透明质酸酶做佐剂包被构建的3种DNA疫苗后免疫小鼠,并对免疫小鼠做了抗体水平、脾脏淋巴细胞增殖试验、NK细胞杀伤活性、脾细胞中不同淋巴细胞亚群含量变化等方面的检测。结果证实,试验设计的DNA疫苗均能诱导小鼠产生针对PCV2的特异性免疫反应,其中以体液免疫较细胞免疫变化显著。此为首次利用合成核定位肽和透明质酸酶作为DNA疫苗的佐剂进行了PCV2DNA疫苗的探索性研究,为DNA疫苗的研究积累了有用数据。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:S852.659.2

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【引证文献】
中国期刊全文数据库 前1条
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中国博士学位论文全文数据库 前10条
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中国硕士学位论文全文数据库 前10条
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【同被引文献】
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中国硕士学位论文全文数据库 前1条
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