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《西北农林科技大学》 2008年
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鸡气管黏膜上皮细胞共培养体系的建立及IBV致细胞病变作用的研究

孙裴  
【摘要】: 气管是病原体入侵机体一个重要入口,气管黏膜上皮细胞(Trachea epithelium cells,TECs)既是许多病原体作用的靶细胞,也是阻挡病原入侵的一个重要屏障。近10年来上皮细胞分离培养研究取得了重大进展,人、哺乳动物及啮齿类动物TECs离体培养已常用来评价细胞的特性和行为,在气液界面培养模型系统中TECs广泛应用于呼吸道疾病发生机制、病原体致TECs病变机理、药物筛选和转运等研究。尚未见到鸡气管黏膜上皮细胞(Chicken trachea epithelium cells, CTECs)分离培养的文献。目前常用的TECs培养条件无法有效地促进CTECs体外培养,因此我们对CTECs体外培养技术进行了探索,旨在建立CTECs体外培养技术为以CTECs为细胞模型的研究提供材料。 鸡传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)不断地发生变异,出现了不同的血清型,而不同血清型之间缺乏交叉保护性,使得利用常规免疫去阻止该疾病的传播变得更加困难,各国学者试图从基因水平上阐明IBV感染、复制和变异的分子机制及病毒组织嗜性、毒力相关分子机理,为该病的防控提供理论基础。IBV在活体中的首发复制位置为CTECs,进行IBV在体外CTECs中的增殖特性研究可以为上述研究提供理论基础。另外,许多IBV地方分离株不适应细胞培养,对IBV在CTECs中培养特性的研究,可为IBV地方流行毒株的分离、鉴定和基础应用研究寻找理想的宿主细胞。为了上述目的,我们进行了CTECs共培养体系的建立和IBV在CTECs中的致病性研究,获得了以下结果: 1.利用链酶蛋白酶灌注气管过夜冷消化法和3步纯化法,获得了纯度非常高的原代CTECs。刚分离下来的CTECs为亮球形,多成单个存在,细胞体积较红细胞大,多数细胞纤毛清晰可见,纤毛摆动不止。细胞活性检测可达90%。该法获得的CTECs为进一步的CTECs培养提供了很好的种子细胞。 2.为了探索CTECs培养条件,在单独培养CTECs时,还平行分离培养了猪、兔、小鼠TECs。研究结果发现,同样的培养方法和条件,猪、兔、小鼠TECs贴壁率高,能在48h左右完全铺满培养皿底,细胞排列呈现典型的“铺路石”状,甚至猪TECs能够连续传代8代以上。然而,CTECs贴壁率非常低,细胞数量少,呈小片状散在生长,无法铺满培养皿底,细胞存活期较短,更无法传代。通过分析研究结果推测,由于鸡和哺乳动物细胞因子受体同源性很低,而目前TECs培养所用的促细胞贴壁和生长因子主要来自于人或牛等哺乳动物,故对禽源细胞促进生长效果就不明显,CTECs贴壁、增殖受限。 3.为了解决CTECs体外培养问题,利用CTECs与鸡胚成纤维细胞(Chick embryo fibroblast,CEF)共培养体系来观察CTECs生长状况,并事先探索了共培养体系培养液的最佳类型。本试验采用PCF插入式Millicell套皿装置,Millicell培养皿中的滤膜上培养CEF,培养皿底部培养CTECs,微孔滤膜的直径(0.4μm)允许两种细胞分泌的因子通过和交换,发挥其对CTECs的生长促进作用。并且CTECs和CEF由滤膜隔开,可对CTECs和CEF单独进行观察和分析。研究结果显示,共培养的CTECs能在72 h以内完全铺满培养皿底,细胞排列呈现典型的“路石”状,细胞数目及细胞活力较单独培养有明显增加。初步表明CTECs与CEF共培养体系的建立,很好地改善了CTECs体外培养状态,可为进一步的CTECs体外研究和应用提供技术保证。 4.应用套皿包被有血清气液界面共培养法(人胚胎胶原包被套皿支持膜,膜上以气液界面形式培养CTECs,培养皿底培养CEF,培养液含有低浓度的鸡血清),成功地模拟了体外CTECs的生长条件。与传统单层细胞培养相比,气液界面培养的CTECs呈假复层生长,细胞存活期大大延长,使CTECs结构上尽量接近于天然气管黏膜上皮组织,有利于CTECs体外分化、成熟及功能表达,从而为药物筛选、呼吸道疾病发病机制、病原体与上皮细胞互相作用的研究提供理想的体外细胞培养方法。 5.通过给单层生长的CTECs分别接种4株IBV标准毒株、地方分离株,来研究IBV在CTECs中的培养特性。结果显示,4株IBV均不需要在CTECs上传代适应,在首次感染CTECs 72 h以内致CTECs发生病变,以纤毛细胞纤毛脱落、细胞器受损、核仁裂解、细胞膜崩解为特征。IBV在CTECs中培养的细胞毒给鸡胚接种,在鸡胚上连续传1~3代,便可见IBV引起鸡胚发育受阻或鸡胚死亡的特征性变化。对照组Marc145细胞连续盲传到10代未见细胞病变的发生,并且在接毒72h以内检测各组细胞中的病毒浓度,结果显示,接毒CTECs中的病毒浓度明显高于同期的Marc145细胞中的病毒浓度。说明IBV能在CTECs中增殖,并且比在Marc145细胞中病毒增殖的数量多。4株IBV低代次的鸡胚分离株均可在细胞培养物中生长并很快诱导CTECs发生细胞病变,可见CTECs是IBV增殖较为理想的宿主细胞,可为IBV致病机制研究提供良好的细胞模型,为IBV分离、鉴定和血清学检查与基础研究提供技术支持。 综上所述,本研究成功地建立了CTECs体外培养技术,尤其是建立了CTECs气液界面共培养体系,使体外培养的鸡气管黏膜上皮在结构和功能上尽量接近黏膜上皮天然结构,可为鸡气管黏膜上皮相关研究提供细胞模型。并且成功地应用到IBV在其中增殖特性和致细胞病变的研究,为IBV体外细胞培养寻找到一个较为理想的宿主细胞。这些研究结果在国内外均属首次报道。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:S858.31

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