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《西北农林科技大学》 2008年
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卫矛科植物内生菌的分离及其农药生物活性研究

杨春平  
【摘要】: 植物内生菌作为筛选农用抗生素的一类资源微生物,在农药的研究与开发中越来越受到重视。为了开发卫矛科植物内生菌资源,以期发现新的具有农药研究价值的微生物,本论文对4种卫矛科植物内生菌进行了研究,主要涉及菌种的分离、筛选、菌株鉴定、菌株诱变选育、代谢产物活性及活性成分分离以及发酵条件优化等的研究,取得了如下结果: (1)分别采用组织块培养法和匀浆法从4种新鲜卫矛科植物中分离到161株内生真菌和28株内生放线菌,通过杀虫活性、抑菌活性及遗传稳定性实验,从中筛选到能产生抑菌活性成分的内生真菌3株(Hd3、2QR1和1F8)和内生放线菌4株(a4、a5、c4和YDG17)。其中,菌株Hd3和2QR1的代谢产物也具有杀虫活性。 (2)利用引入链霉素耐药性,分别对5株无抑菌活性和1株弱抑菌活性的卫矛科植物内生放线菌进行诱突,共获得链霉素变异株301株。对301株变异菌株发酵产物以枯草芽孢杆菌为指示菌进行活性筛选,获得具有显著抑菌活性且遗传稳定的突变株2株,即YDG05-44和YDG09-32。室内生物测定结果表明,YDG05-44和YDG09-32菌株的发酵产物对其它几种细菌及植物病原真菌也具有显著的抑菌活性。 (3)对YDG17、YDG09-32和Hd3菌株的发酵条件进行了优化研究,确定了最佳培养基组成及培养条件。响应面分析及正交实验结果表明,YDG17菌株发酵的摇瓶培养基配方为:葡萄糖32.00 g/L,小米28.77 g/L,蛋白胨3.00 g/L。发酵条件为:pH 7,250mL三角瓶装60mL发酵液,接入6×10~7cfu/mL菌量,32℃培养120h。YDG09-32菌株发酵的摇瓶培养基配方为:乳糖21.06 g/L,小米20.82 g/L,牛肉膏4.72 g/L,MgSO_4·7H_2O 0.38g/L。发酵条件为:pH 7~9,250mL三角瓶装80mL发酵液,接入6×10~6cfu/mL菌量,29℃培养96h。Hd3菌株的摇瓶培养基配方为:葡萄糖24.71g/L,MgSO_4·7H_2O 1.08 g/L,土豆244.17 g/L。发酵条件为:pH 6~7,250mL三角瓶装90mL发酵液,接入9×10~3cfu/mL菌量,31℃培养9d。 (4)研究了YDG17菌株的代谢产物。室内生测结果表明,YDG17菌株的发酵液对几种供试细菌和病原真菌均有一定的抑制作用。对枯草芽孢杆菌(Bacillus subtills)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、大肠杆菌(Escherichis coli)、绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)的抑菌圈直径分别为27.0,27.0,15.3,11.3,14.0mm。对小麦赤霉病菌(Fusarium graminearum)、番茄灰霉病菌(Botrytis cinerea)、番茄早疫病菌(Alternaria solani)、西瓜枯萎病菌(Fusariumoxysporum f.sp.niveum)和桃腐烂病菌(Cytospora leucostoma)抑制菌丝生长的EC_(50)(以发酵液中的干物质计)值分别为259.98、336.13、100.72、470.11和198.58mg/L;对小麦赤霉病菌(F.graminearum)、西瓜枯萎病菌(F.oxysporum f.sp.niveum)和番茄灰霉病菌(B.cinerea)抑制孢子萌发的EC_(50)值为分别为151.67、220.69和87.84mg/L。离体子叶法测定结果表明,发酵液原液对番茄灰霉病的保护效果为97.62%,治疗效果为79.63%。盆栽试验结果表明,发酵液原液对番茄灰霉病的保护效果为71.34%,治疗效果为64.23%。 通过捷克八溶剂系统纸色谱测定YDG17菌株发酵液中主要活性成分为碱性水溶性抗生素。采用离子交换法,通过抑菌活性追踪法,分离得到YDG17菌株发酵液的主要抑菌活性组分YA,ESI-MS/MS对YA化学成分进行分析,结果表明YA中的主要活性成分为链丝菌素类化合物,通过MS/MS谱图和母离子碎片峰信息,以及与标准化合物谱图进行对比,鉴定其中5个化合物为N-乙酰化链丝菌素D、N-乙酰化链丝菌素C、链丝菌素D、链里定酸-链丝菌素E和链丝菌素F。 (5)研究了YDG09-32菌株的代谢产物。离体活性测定结果表明,YDG09-32菌株的发酵滤液和菌丝体中均有含有抑菌活性成分,不仅对供试细菌有一定的抑制作用,同时对小麦赤霉病菌(F.graminearum)、玉米弯孢菌(Curvularia lunta)、番茄灰霉病菌(B.cinerea)和苹果炭疽病菌(Colletotrichum gloeosporioides)等植物病原真菌有较强的抑制活性。 通过Doskocilova八溶剂系统分析,判断YDGA09-32菌株发酵滤液和菌丝体提取物中的抑菌活性成分为同一类物质,即放线菌素类抗生素。YDG09-32菌株代谢的抑菌活性成分对光、热、酸和碱均有较好的稳定性。发酵产物在pH 5~11之间处理3h,或在90℃处理30min以及日光照射10d后,对抑菌活性均无明显影响。采用大孔吸附树脂吸附、硅胶柱层析及薄层制备等技术对YDG093-32菌株发酵滤液中抑菌成分进行分离纯化,得到Bh1~Bh7 7个组分,生测结果表明,仅组分Bh1、Bh5和Bh6对枯草芽孢杆菌具有较好的抑菌活性。Bh1~Bh7组分由于纯度不够,未能进行结构鉴定。 (6)研究了Hd3菌株的代谢产物。分别对Hd3菌株菌丝体甲醇、乙酸乙酯和石油醚提取物及发酵滤液乙酸乙酯萃提物进行了杀虫、抑菌活性研究。结果表明,Hd3菌株的杀虫活性物质主要存在于菌丝体乙酸乙酯提取物中,在1000mg/L时,对粘虫3龄幼虫的24h死亡率为100%;抑菌活性物质主要在发酵液中,其乙酸乙酯萃取物对小麦根腐病菌(Bipolaris sorokiniana)、苹果炭疽病菌(C.gloeosporioides)、小麦赤霉病菌(F.graminearum)、番茄灰霉病菌(B.cinerea)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum)和玉米弯孢菌(C.lunta)抑制菌丝生长的EC_(50)值分别为77.7,74.9、75.6、138.3、166.0和130.9 mg/L,对棉花枯萎病菌(F.oxysporumf.sp.vasinfectum)、番茄灰霉病菌(B.cinerea)、小麦根腐病菌(B.sorokiniana)和玉米弯孢菌(C.lunta)抑制孢子萌发EC_(50)值分别为184.4,102.8,154.5和79.7mg/L;盆栽试验结果表明,Hd3菌株发酵滤液乙酸乙酯萃取物在浓度为2000mg/L时,对小麦白粉病的保护和治疗效果分别为61.9%和81.6%。 对Hd3菌株菌丝体乙酸乙酯提取物中的杀虫活性成分进行分离,得到一个纯化合物H4.5,经波谱分析,鉴定为2,3-二甲氧基-5-甲基苯酚,该化合物对3龄粘虫(平均体重3.75mg)的LD_(50)为3.78μg/头。通过活性追踪,采用硅胶柱层析、HPLC制备对菌株发酵滤液乙酸乙酯萃提物中抑菌活性成分进行分离,得到H03~H09,H20 8个化合物,生测结果表明,化合物H03、H04、H20具有较强的抑菌活性。经波谱分析,化合物H03、H04、H05、H07、H08和H20分别鉴定为geodin、chlorotrypacidin、methyl asterrate、methyl dichloroasterrate、methyl chloroasterrate和asterric acid,均为首次从内生黄柄曲霉代谢物中分离到的化合物。 (7)通过对YDG17、YDG09和Hd3菌株形态学及分子生物学鉴定,确定Hd3菌株为曲霉属真菌:YDG09和YDG17菌株均为链霉菌属放线菌。 YDG17菌株与菌株S.vinaceusdrappuss的16SrDNA同源性为99%,同时,菌株在形态特征、培养特征、生理生化特征等方面与模式菌株也比较相似。因此,将YDG17菌株鉴定为Streptomyces vinaceusdrappuss。 YDG09菌株与模式菌株S.rubrolavendulae的16SrDNA同源性为99%。除了YDG09菌株不利用阿拉伯糖、甘露醇而利用鼠李糖及在克氏一号培养基上难于生长与S.rubrolavendulae菌株存在差异外,在生理生化及形态特征上两株菌均相似。因此,建议将YDG09菌株定为S.rubrolavendulae菌株的一个变种(Streptomycesrubrola vendulae var euonymus)。 Hd3菌株与模式菌株Aspergillus flavipes的ITS区序列同源性为100%,在形态特征等方面两株菌也相似,因此,鉴定Hd3菌株为黄柄曲霉Aspergillus flavipes。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2008
【分类号】:S482.2

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6 王斌;肖冰梅;王海河;佘朋桂;;茄科曼陀罗属植物的研究进展[A];中华中医药学会第十届中药鉴定学术会议暨WHO中药材鉴定方法和技术研讨会论文集[C];2010年
7 田小曼;吴云锋;;青蒿内生菌的分离及其抑菌活性研究[A];中国植物病理学会2009年学术年会论文集[C];2009年
8 戴文君;张秀环;黄贵修;戴好富;梅文莉;;见血封喉内生真菌的分离鉴定及抑菌活性研究[A];2008年中国微生物学会学术年会论文摘要集[C];2008年
9 葛瀚麟;邹建华;陈晓光;戴均贵;;番荔枝内生真菌中抗肿瘤活性成分的研究[A];2009年中国药学大会暨第九届中国药师周论文集[C];2009年
10 臧威;何旭;熊洪亮;孙剑秋;宋瑞清;于文喜;;东北地区桦木内生真菌的分离及其抑菌活性产物的初步研究[A];2010年中国菌物学会学术年会论文摘要集[C];2010年
中国重要报纸全文数据库 前10条
1 记者 刘云涛;中科院应化所推出分离新工艺[N];中国医药报;2006年
2 李运红胡颜;我国科学家首次从壁虎中分离出抗肿瘤活性成分[N];医药经济报;2007年
3 刘岱琳 曲戈霞 王乃利;瓜蒌抗血小板聚集活性成分被探明[N];中国医药报;2005年
4 ;大枣多糖是大枣补气生血的主要活性成分[N];中国中医药报;2005年
5 刘道安通讯员 运红 胡颜;壁虎中分离出抗肿瘤活性成分[N];健康报;2007年
6 健康时报记者 薛京;服降血脂药别吃柚子[N];健康时报;2007年
7 张国斌记者 刘继刚;我市首个博士后科研工作站挂牌[N];宜春日报;2007年
8 本报记者 王华锋;建立药物非活性成分数据库十分必要[N];中国医药报;2010年
9 程书权;中药系列活性成分治疗肝病的现代研究[N];中国中医药报;2004年
10 记者 陈建强通讯员 李运红 胡颜;国内首次从壁虎中分离出抗肿瘤活性成分[N];光明日报;2007年
中国博士学位论文全文数据库 前10条
1 杨春平;卫矛科植物内生菌的分离及其农药生物活性研究[D];西北农林科技大学;2008年
2 易晓华;除虫菊内生真菌分离、鉴定及其代谢产物抑菌活性研究[D];西北农林科技大学;2008年
3 姬志勤;秦岭链霉菌次生代谢物中生物活性成分研究[D];西北农林科技大学;2007年
4 秦建春;四种内生真菌、一种放线菌和一种高等真菌次生代谢物质及生物活性研究[D];西北农林科技大学;2009年
5 范丽霞;几株放线菌发酵液抑菌活性成分的研究[D];西北农林科技大学;2013年
6 张文娟;Streptomyces djakartensis NW35菌株发酵液的抑菌活性及抑菌成分研究[D];西北农林科技大学;2013年
7 王芳;苦参内生拮抗细菌筛选及其抗菌物质纯化鉴定[D];沈阳农业大学;2009年
8 郭正彦;Streptomyces alboflavus 313发酵液中抑菌成分的研究[D];西北农林科技大学;2009年
9 计红芳;防治杨树叶枯病的毒蘑菇菌株筛选及其生防机理研究[D];哈尔滨工业大学;2007年
10 刘小莉;银杏内生真菌分离鉴定及其抗菌抗氧化作用研究[D];南京农业大学;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 顾爱国;苦皮藤内生真菌农用活性成分的研究[D];西北农林科技大学;2004年
2 武金占;苦皮藤内生真菌筛选及其代谢产物的农药活性研究[D];西北农林科技大学;2007年
3 李雅;杜仲内生真菌抑菌活性成分的研究[D];西北农林科技大学;2007年
4 刘彦;穿龙薯蓣内生菌研究Ⅱ[D];黑龙江中医药大学;2009年
5 何映霞;珙桐产黄酮内生真菌的分离及鉴定[D];贵州大学;2008年
6 乔港;星叶草内生菌抑菌活性研究[D];西北农林科技大学;2013年
7 王丽;内蒙古乌拉尔甘草内生真菌拮抗菌株的鉴定及其活性物质的初步研究[D];首都师范大学;2009年
8 陈志敏;火棘内生真菌的分离及其抑菌活性研究[D];西北农林科技大学;2010年
9 朱红薇;杜仲内生真菌活性物质的研究[D];西北农林科技大学;2005年
10 杨磊;野木瓜(Stauntonia chinensis DC.)镇痛有效部位化学成分的研究[D];沈阳药科大学;2007年
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