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《西北农林科技大学》 2009年
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长春碱纳米粒的制备及其抗肿瘤作用的实验研究

刘玉梅  
【摘要】:为了探索传统抗肿瘤药物的新剂型,以聚氰基丙烯酸正丁酯纳米粒为载体制备了长春碱纳米粒,选用肿瘤细胞BT325和C6作为模型,考察了长春碱纳米粒的抗肿瘤活性,并对该制剂的质量性能和药动特征进行系统研究。 一、长春碱纳米粒的制备 1.长春碱纳米粒分析方法的建立 建立了用于长春碱纳米粒含量检测的高效液相色谱(HPLC)分析方法,并对该方法进行全面验证。结果显示,在10~320μg·mL-1浓度范围内线性关系良好,平均回收率相对标准偏差(RSD)为0.34%,平均保留时间RSD为0.93%,日内精密度RSD为2.72%,日间精密度RSD为3.33%。本研究建立的长春碱纳米粒的HPLC分析方法,稳定可靠、专属性和重复性好,为长春碱纳米粒的制备奠定了基础。 2.长春碱纳米粒的制备及质量评价 采用乳化聚合法制备长春碱纳米粒,并对其进行质量评价。结果显示,优化的最佳制备工艺为:反应介质pH值2,Dextran70 1%(W/V),长春碱0.5%(W/V),BCA单体1%(V/V),搅拌速度600 r·min-1,搅拌时间8 h。按优化条件制备的长春碱纳米粒包封率和载药量分别为78.39%和39.20%,平均粒径为74.4 nm,分布范围较窄,粒子圆整光滑,大小均匀,分散良好,无黏附团聚现象,冷冻干燥后室温下保存,稳定性良好。 3.长春碱纳米粒的安全性评价 通过溶血性试验、细胞毒性试验和急性毒性试验对长春碱纳米粒的体内外安全性进行系统评价。结果显示,长春碱纳米粒无溶血和凝集现象;5000 ng·mL-1长春碱纳米粒对大鼠星形胶质细胞的增殖抑制率为(42.27±3.75)%,比相同浓度的长春碱生理盐水溶液降低了9.56%,差异显著(P0.05);对L929细胞的相对增殖度为(30.07±1.44)%,比相同浓度的长春碱生理盐水溶液提高了9.62%,差异极显著(P0.01)。长春碱纳米粒的半数致死量为26.38 mg·kg-1,比长春碱生理盐水溶液组提高了16.21%。由此证实,长春碱纳米粒能降低长春碱对机体的毒性。 二、长春碱纳米粒的抗肿瘤作用研究 1.长春碱纳米粒对肿瘤细胞BT325、C6增殖和凋亡的影响 通过MTT试验、细胞生长曲线测定和克隆形成试验,考察长春碱纳米粒对肿瘤细胞BT325和C6生长的抑制作用;用倒置显微镜直接观察和HE染色方法研究长春碱纳米粒对肿瘤细胞BT325和C6整体形态的影响;用透射电镜和扫描电镜观察长春碱纳米粒对肿瘤细胞BT325和C6超微结构和表面结构影响;用Hoechst33342荧光染色观察长春碱纳米粒对肿瘤细胞BT325和C6的核形态影响;用间接免疫荧光FITC染色观察长春碱纳米粒对肿瘤细胞C6的微管形态影响。结果表明,长春碱纳米粒作用于肿瘤细胞BT325,C6的IC50分别为33.88和97.72 ng·mL-1,比长春碱生理盐水溶液降低了4.62和1.14倍,在培养的第2~7天时细胞数量显著减少(P0.05),克隆形成率分别为22.27%和18.8%,比长春碱生理盐水溶液降低了9.31%和5.68%;与长春碱生理盐水溶液相比,长春碱纳米粒组细胞数量明显减少,细胞间距变大,很多细胞脱落漂浮于培养液中,皱缩变圆、核染色加深以及两端突起消失的细胞增多;Hoechst33342染色后,细胞多呈现亮蓝色荧光;肿瘤细胞表面微绒毛消失,细胞膜出现大面积的穿孔现象,染色体边集,细胞内出现空泡,整个细胞失去结构完整性,呈典型的凋亡状态,且凋亡程度比长春碱生理盐水溶液组严重;肿瘤细胞C6的微管蛋白解聚,绿色荧光弥散于整个细胞,有些细胞发生皱缩,部分细胞两端成纤维样的突起消失。由此证实,长春碱纳米粒增强了对肿瘤细胞BT325,C6的增殖抑制作用和凋亡诱导作用。 2.长春碱纳米粒对肿瘤细胞BT325裸鼠移植瘤的抑制作用研究 通过比较裸鼠移植瘤体积、抑瘤率以及瘤块组织形态学变化研究了长春碱纳米粒对肿瘤细胞BT325裸鼠移植瘤的抑制作用,通过检测裸鼠外周血白细胞数量,考察长春碱纳米粒在裸鼠体内的骨髓抑制毒性。结果表明,长春碱纳米粒组的瘤重为(0.87±0.15)g,抑瘤率比长春碱生理盐水溶液组提高了18.42%,差异显著(P0.05);肿瘤中呈现核深染的凋亡样细胞增多,肿瘤中心有明显的坏死灶;长春碱纳米粒组的裸鼠外周血白细胞数量为(1.30±0.23)×109个/L,是长春碱生理盐水溶液的1.71倍,差异极显著(P0.01)。由此证实,长春碱纳米粒增强了对肿瘤细胞BT325裸鼠移植瘤的抑制作用并降低了长春碱的骨髓抑制毒性。 3.长春碱纳米粒对肿瘤细胞C6大鼠移植瘤的抑制作用研究 通过比较荷瘤大鼠生存期和脑组织形态学变化研究了长春碱纳米粒对肿瘤细胞C6大鼠移植瘤的抑制作用,通过检测大鼠外周血白细胞数量,考察长春碱纳米粒在大鼠体内的骨髓抑制毒性。结果显示,Tween-80修饰前后的长春碱纳米粒组荷瘤大鼠生存期分别为(72.16±4.04)d和(89.54±4.51)d,比长春碱生理盐水溶液组延长了35.31%和67.90%,差异极显著(P0.01);与长春碱生理盐水溶液组相比,长春碱纳米粒组的肿瘤组织内血管减少,向周围脑组织浸润的肿瘤细胞数量下降;长春碱纳米粒组的大鼠外周血白细胞数量为(15.93±2.89)×109个/L,是长春碱生理盐水溶液组的2.52倍,差异显著(P0.05)。由此证实,长春碱纳米粒增强了对肿瘤细胞C6大鼠移植瘤的抑制作用并降低了长春碱的骨髓抑制毒性。 三、长春碱纳米粒在家兔体内的药物代谢动力学研究 为了解长春碱纳米粒在机体内的动态变化规律,建立了家兔血浆中长春碱纳米粒含量测定的HPLC方法,利用残数法拟合该纳米粒制剂与传统剂型在家兔体内的动力学方程,并对动力学参数进行比较分析。结果显示,本研究建立的家兔血浆中长春碱纳米粒含量测定的HPLC方法稳定、可靠,重复性和专属性好,在10~320μg·mL-1浓度范围内线性关系良好,平均回收率RSD为1.54% ,平均保留时间RSD为1.25%,日内精密度RSD为3.23%,日间精密度RSD为2.65%。药动学研究表明,长春碱纳米粒和长春碱生理盐水溶液均属静脉注射二室模型,长春碱纳米粒的消除半衰期为9.071 h,是长春碱生理盐水溶液的2.39倍,血浆清除率为长春碱生理盐水溶液1/3.17,药时曲线下面积为长春碱生理盐水溶液的3.16倍。由此证实,长春碱纳米粒显著延长了长春碱在血液中的循环时间,具有一定的缓释作用。 本研究制备的长春碱纳米粒工艺可行、性能稳定,抗肿瘤活性显著增强,并能降低长春碱对机体的毒副作用,为长春碱长期反复应用于肿瘤的治疗提供了科学依据。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:R318.0;R73-3

【引证文献】
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【参考文献】
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【同被引文献】
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2 张静;油酰壳聚糖纳米粒作为抗肿瘤药物载体的研究[D];中国海洋大学;2010年
3 陈名懋;选择性胆甾化壳聚糖衍生物纳米药物载体的研究[D];北京协和医学院;2011年
4 张玮;基于微针给药的靶向黑素细胞抗色素沉着纳米粒的研究[D];第二军医大学;2011年
5 张雪琼;羧甲基壳聚糖智能释药肝靶向纳米传递系统的构建与评价[D];武汉理工大学;2010年
6 胡三元;载恩度PEG-PLGA纳米粒的制备及对结肠癌的治疗作用研究[D];中南大学;2011年
7 李博;c(RGD)fk介导双载药核壳型脂质纳米粒给药系统的研究[D];浙江大学;2012年
8 姜子荣;载药聚氰基丙烯酸丁酯纳米粒治疗脑胶质瘤的研究[D];苏州大学;2008年
9 袁海龙;蕨麻抗肝炎药效物质及其肝靶向纳米粒冻干粉针剂的药学研究[D];成都中医药大学;2004年
10 徐爱民;载VEGF反义寡核苷酸纳米粒抑制大鼠肝癌新生血管作用的实验研究[D];第二军医大学;2004年
中国硕士学位论文全文数据库 前10条
1 李斌生;载绿色荧光蛋白基因壳聚糖纳米粒载体的制备和转染的研究[D];中南大学;2004年
2 佟媛;载银杏内酯A纳米粒的制备与理化性质研究[D];安徽大学;2010年
3 郭妍;纳米生物技术治疗肝癌:p53-白蛋白纳米粒的制备和转染的研究[D];中南大学;2004年
4 王娜;治疗高尿酸血症UOX脂质纳米粒的初步研究[D];重庆医科大学;2010年
5 张庆莲;米托蒽醌聚乳酸纳米粒的制备和细胞摄取研究[D];成都中医药大学;2011年
6 吉顺莉;紫杉醇PLGA口服纳米粒的制备及生物利用度的研究[D];江苏大学;2010年
7 王同力;Tf-BCNU-PLGA纳米粒制备及其对鼠C6胶质瘤细胞作用的实验研究[D];中国人民解放军军医进修学院;2010年
8 蒋妮;三种齐墩果酸纳米粒的制备及质量评价[D];大连医科大学;2010年
9 乔伟立;用于两种药物控制释放的纳米粒/静电纺丝复合纤维给药系统的研究[D];重庆大学;2010年
10 应晓英;纳米粒载体与A549肺上皮细胞的相互作用及其体内药效学研究[D];浙江大学;2002年
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