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《西北农林科技大学》 2009年
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恩诺沙星残留免疫学快速检测技术研究

赵银丽  
【摘要】:恩诺沙星(Enrofloxacin,ENR)属于人工合成的氟喹诺酮类药物,在畜禽细菌性疾病的治疗中被广泛应用。但是恩诺沙星在动物可食性组织中的残留问题对人类健康造成一定的威胁,恩诺沙星残留可通过食物链引起人类对食源性疾病的耐药性增加。许多国家对其最大残留限量均做了规定。传统的理化分析方法,包括液相色谱、液质连用等,虽然结果准确,但是样品前处理复杂,对仪器设备和工作人员的要求较高,不适合做残留的快速筛选和现场检测。免疫学分析技术以其灵敏、特异、快速、简便等优点在药物残留快速检测领域被广泛应用。本研究对ENR的免疫原性、人工完全抗原的合成、多克隆抗体(pAb)和单克隆抗体(mAb)的制备、ELISA试剂盒研制、免疫金标试纸研制、液-质联用(LC-MS)对试剂盒和免疫金标试纸的确证等内容进行了充分的研究。 1.在分析ENR分子结构和免疫原性基础上,采用N-羟基琥珀酰亚胺活性酯法和氯甲酸异丁酯法将ENR分别与牛血清白蛋白(BSA)和卵清白蛋白(OVA)偶联制备免疫抗原(BSA-ENR)和包被抗原(OVA-ENR)。经紫外扫描和SDS-PAGE电泳分析表明,半抗原ENR成功偶联在蛋白质载体上,并且不同方法产生的偶联比不同,同种方法不同偶联条件产生的结果也不同。将不同偶联比(1∶29;1∶16;1∶9)的BSA-ENR免疫Balb/C小鼠,用间接ELISA和间接竞争ELISA测定抗体效价和半数抑制浓度,不同方法偶联的BSA-ENR产生的效价和抑制效果也有所不同,从而为单克隆抗体制备筛选最佳的融合小鼠提供试验依据。 2.用BSA-ENR免疫新西兰大白兔3只,8次免疫后获得了ENR pAb,经鉴定,其间接ELISA效价为1∶2.56×105,阻断ELISA测定半数抑制浓度(IC50)为11μg/L,与其它化合物的交叉反应率(CR%)0.1%,ELISA和West-Gold实验结果表明产生了针对ENR的特异性抗体。 3.用BSA-ENR免疫Balb/C小鼠9只,5次免疫后用间接ELISA和阻断ELISA选择出细胞融合备用小鼠,应用细胞融合技术筛选出4G1-B3、4G1-G1共2株敏感特异的杂交瘤细胞,用体内诱生腹水法制备ENR mAb,经鉴定,其间接ELISA效价细胞培养上清分别为1∶1280和1∶640,腹水分别为1∶1.024×106和1∶5 .12×105,亚类鉴定均为IgG1,亲和常数(Ka)分别为9×1010L/mol和4.5×1010L/mol,其中亲和力最高的4G1-B3株阻断ELISA测定其IC50为1.59μg/L,与其他化合物的CR%均0.01%,ELISA和West-Gold实验结果表明与ENR特异性结合。本实验制备的ENR pAb和ENR mAb均可用于ENR残留检测的免疫学试验,但ENR mAb的性能更好。 4.应用ENR mAb研制出ENR残留快速检测阻断ELISA和竞争ELISA试剂盒(ENR-Kit),其中竞争ELISA试剂盒的质量性能稍优于阻断ELISA试剂盒,ENR-Kit的标准曲线呈S型,符合4参数logit曲线拟合,灵敏度为0.053μg/L,检测限为0.25μg/L,线性检测范围为0.053~101.6μg/L,IC50为1.1μg/L;牛奶样、鸡肉样、鱼肉样的平均添加回收率分别为97.25%、84.28%和85.95%;平均批内和批间变异系数均小于15%;ENR-Kit与其他化合物的CR%均0.01%,不同生物基质对ENR-Kit的检测结果影响小;ENR-Kit在4℃可保存6个月以上。 5.依据胶体金免疫层析试验(GICA)原理,应用ENR mAb研制ENR残留快速检测免疫金标试纸(ENR-Strip),最佳胶体金粒度为25±1.0 nm,适宜标记浓度为3.5μg IgG/mL金;ENR-Strip的标准曲线呈S型,符合4参数logit曲线拟合,机读检测限为0.2μg/L,目测检测限为1.0μg/L;与其他化合物的CR%均0.1%;ENR-Strip在4℃干燥条件下可保存6个月以上。 6.建立了鸡肉中ENR残留检测的LC-MS法,并以此方法确证了ENR-Kit和ENR-Strip的敏感性、特异性和稳定性,符合率为100%,两种产品均具有快速、敏感、特异、简便等特点,适合于ENR残留快速检测的推广应用。
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