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《西北农林科技大学》 2009年
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大豆花叶病(SMV)抗性基因鉴定、分子验证、基因聚合与表达研究

李得孝  
【摘要】:大豆花叶病(SMV)是全球主要大豆产区分布最广的病毒性病害之一。全球范围内大豆种质交流和新的强毒力病毒株系的不断出现,使大豆安全生产面临挑战。大豆花叶病毒归马铃薯Y病毒科(Potyviridae)、马铃薯Y病毒属(Potyvirus),寄主范围狭窄,主要局限于豆科植物。可通过受侵染的种子,蚜虫和机械接种传播。植株受SMV侵染后,通常出现三种反应:无症状或仅在接种叶有局部致死斑(抗病类),致死(局部致死或整株致死)及花叶症状(感病类)。大豆对SMV的侵染反应受寄主基因型、病毒株系、侵染时期和环境条件(特别是温度)的影响。依据一套大豆鉴别材料的表型反应,美国已鉴定出7个SMV病毒株系(G1-G7),而在中国和日本,利用不同的大豆材料鉴定出不同的病毒株系,但各地鉴定的株系之间的关系尚不清楚,有待建立统一的病毒株系鉴别体系。美国利用Cho Goodman(1979)的鉴别体系已经鉴定出位于大豆不同连锁群(MLG-F,-B2,-D1b)上的3个抗性基因位点(Rsv1,Rsv3,Rsv4),并在Rsv1位点发现9个等位基因。对SMV和大豆互作中是否存在“一因多效”现象,国内外专家的认识存在分歧。中国学者认为大豆对不同病毒株系的抗性受不同基因控制,不存在“一因多效”现象,而美国专家认为,SMV抗性基因的作用是“多效的”。分子标记作图的结果表明,中国报道的抗性基因位点与美国鉴定的基因基本重合。 本研究在美国大豆花叶病鉴别体系的基础之上,进行了如下研究:(1)发掘大豆种质中新的SMV抗病基因,为大豆抗SMV育种提供多样化抗源,提高大豆抵抗病毒侵袭的能力;(2)结合经典遗传研究,探讨利用与抗性位点紧密连锁的分子标记确定抗性基因的可能性;(3)利用分子标记辅助选择育种技术聚合多个抗性基因,创制大豆新抗源,为广谱持久抗性材料的选育提供有用的育种种质;(4)研究抗性基因杂合状态下,温度对致死反应的影响,深化对大豆抗病基因与病毒互作机制的认识。 研究用6个株系(G1~G3,G5~G7)鉴定了127份大豆材料的抗性反应、甄别这些材料中携带的可能抗性基因。结果显示:84份材料携带Rsv1位点上的抗性基因,分别是Rsv1-y 42份, Rsv15份,Rsv1-k 19份,8份Rsv1-t, 8份Rsv1-r, 1份Rsv1-n, 1份Rsv1-h;Rsv3位点材料各3份;16份材料可能携带Rsv1, Rsv3,或Rsv4位点上的新基因,比较其与已报道的9个抗性基因对不同病毒株系的反应模式,发现其中9份材料(Kosuzu, Suzumaru, PI 398877, Jitsuka, Clifford, and Tousan 65, Cosica, PI 61944,和PI 61947)可能携带Rsv1位点的新基因,2份(PI 339870 and PI 399091)可能携带Rsv3位点的新抗性基因,5份(KAERI-GNT-220-7, PI 398593, PI 438307, Rhosa和Beeson)可能携带Rsv4位点的新抗性基因。另外,18份材料全抗6个株系,可能携带Rsv1-h, Rsv4, Rsv1Rsv3, Rsv1Rsv4,或Rsv3Rsv4基因。 遗传等位测验显示中国大豆品种J05携带两个独立的大豆花叶病抗性基因Rsv1和Rsv3。研究利用分子标记证实J05携带两个抗性基因。用SMV-G1接种的F(2J05 x Essex)单株,结果很好地符合3:1的分离比例,Rsv1位点附近的三个SSR标记,Satt114, Satt510和Sat_154,可在亲本J05和Essex中扩增出多态性条带,并与F连锁群的基因紧密连锁,证实J05中含有SMV G1的抗性基因Rsv1;选感SMV-G1的F_2单株的F_(2:3)家系接种SMV-G7株系,表现型出现1:2:1的分离比例,证实J05中存在Rsv3并与B2连锁群的两个SSR标记Satt726和Sat_424紧密连锁;但与基因Rsv4紧密连锁的两个标记Satt296和Satt542与SMV的抗性分离表现相互独立,表明J05中不含Rsv4基因。Rsv1和Rsv3位点的这些标记可用于J05中SMV抗性基因选择和聚合的有效分子工具。 试验以J05(Rsv1Rsv3)和V94-5152(Rsv4)做抗性基因供体,利用分子标记聚合Rsv1, Rsv3和Rsv4三个SMV抗性基因。用J05 x V94-5152的F_2:3, F3: 4,和F4:5家系筛选携带三个抗性基因的聚合个体。8个与三个抗性基因连锁的PCR标记被用于分子辅助选择。两个SSR标记(Sat_154和Satt5 10)和一个基因特异性标记(Rsv1-f/r)被用于筛选携带Rsv1的单株; Satt560和Satt063用于筛选Rsv3;Satt266, AI856415和AI856415-g用于筛选Rsv4。有五个F4:5家系在所有8个标记位点上都重合,推测可能已经聚合了3个SMV抗病基因。 迄今在大豆种质中已鉴定出了3个SMV抗性基因位点,Rsv1, Rsv3和Rsv4。Rsv1位点的大多数基因对一些SMV株系(而非全部)表现抗病;Rsv3对G5- G7表现抗病,对G1- G4表现感病;Rsv4对G1-G7表现在幼苗早期抗病。Rsv1位点的抗性基因常表现剂量效应,出现杂合致死;而当与特定的SMV株系互作时,可出现纯合体的致死反应。 研究利用一套Essex等基因系和F_1杂种,探究了在不同温度条件下SMV的致死反应与抗性基因的剂量效应(基因型纯合对基因型杂合)之间的关系。结果表明,SMV侵染导致的致死症状受外界温度的影响。SMV接种携带Rsv3和Rsv4的植株,不论基因纯合或杂合,在所有温度下皆表现无症状。在纯合状态下,V94-3971(Rsv1)、PI 96983 (Rsv1)和V262 (Rsv1-n)植株接种G7或G1后,茎尖致死转化成花叶的温度阈值中分别为30oC, 33oC和33oC。但在杂合状态下,G7接种的F_1(V94-3973 x Essex)的温度阈值为29oC;G7接种的F_1(Essex x PI 96983)为30oC;G1接种的F_1(V262 x Essex)为31oC。而且,在G1接种的F_1(V262 x Essex)和G7接种的F_1(V94-3973 x Essex)杂合体中,还观察到不完全致死症状,即致死和花叶症状是混合出现的。茎尖致死对温度的反应受抗性基因、基因剂量效应、和细胞核背景的影响,细胞质效应可能存在但很有限。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:S565.1

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