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《西北农林科技大学》 2009年
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橙色大白菜原生质体的制备及BcpLHRNAi载体的遗传转化

武云霞  
【摘要】: 以西北农林科技大学蔬菜花卉研究所白菜课题组提供的橙色大白莱(Brassica campestris syn. rapa L. ssp.pekinensis (Lour) Olsson)优良品种金冠2号为试材,就其子叶及下胚轴原生质体游离、纯化方法及影响因素等进行了研究。以橙色大白菜06J28材料,进行BcpLH RNAi载体的遗传转化,就其预培养时间、菌液浓度、菌液浸染时间、共培养时间,选择压等进行了研究。取得如下结果: 1.建立了适宜橙色大白菜金冠2号子叶原生质体游离的条件,即为CPW + DPD培养基+ 0.8%纤维素酶R-10 + 0.1%离析酶R-10 + 0.5 mol/L甘露醇+ 10mM CaCl2.2H2O + 0.7Mm KH2PO4 + 0.1% MES,酶解温度为26±1℃,酶解时间2h,产量达3.52×106个/g.FW,活力60.3 %。 2.建立了适宜金冠2号下胚轴原生质体游离的条件,即为CPW + DPD培养基+ 1.5%纤维素酶R-10 + 0.3%离析酶R-10 + 0.5mol/L甘露醇+ 10mMCaCl2·2H2O + 0.7Mm KH2PO4 + 0.1% MES,酶解时间18 h,产量达2.20×106个/g.FW,活力63.7%。 3.建立了适宜橙色大白菜金冠2号子叶和下胚轴原生质体纯化的条件,即为21 %蔗糖,800 r/min等密度梯度法离心5min纯化原生质体效果最佳。 4.获得了橙色大白菜06J28转BcpLH RNAi的植株。06J 28材料的无菌苗的带柄子叶,预培养2d后,用培养至OD600约0.5的转化农杆菌菌液侵染5 min,共培养2 d后,转入含7 mg/L PPT + 500 mg/L Cef培养基上,直至长出芽;待芽长至2~3 cm时剪下,转入培养基1/2 MS + 5 mg/L PPT + 500 mg/L Cef上诱导生根,将具有除草剂PPT抗性的苗移栽,培育得到43个抗性植株,经PCR检测有1株再生植株含有目的片段。 5.转BcpLH RNAi的植株与对照06J28的植株在幼苗期和结球前期表型上有明显区别。幼苗期时,叶柄比对照更长、叶色偏黄、叶面光泽强、表皮毛减少,叶长椭圆型,无裂刻,株型半直立,其最显著的区别是叶片向上卷曲,形同“瓢状”。结球前期转化大白菜叶片出现明显皱缩,叶片向上卷曲。说明结球大白菜所表现出来的叶片卷曲现象可能和BcpLH基因的表达有关。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2009
【分类号】:S634.1

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