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《西北农林科技大学》 2010年
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E.coli高效感受态细胞转化体系的建立及诱导型瞬时表达载体的构建

杨坤  
【摘要】: 本试验在西北农林科技大学园艺学院蔬菜种质资源与生物技术实验室进行,以实验室种植的拟南芥为试材,通过引物的设计等技术克隆了拟南芥叶片中的诱导型启动子rd29A片段,通过测序等比对,分析了启动子中间的不同响应元件。同时利用启动子rd29A和载体PBI221构建了诱导型植物瞬时表达载体,并通过了酶切检测。本试验的主要结果如下: 1.试验比较了不同方法制备的大肠杆菌感受态细胞的转化效率,并优化了质粒DNA转化感受态细胞的转化体系。结果表明,应用高效法制备的感受态细胞其转化效率极显著高于普通大肠杆菌感受态细胞,转化效率提高了966.1%。-80℃超低温长期保存时,以7%DMSO为冻存保护剂保存的感受态细胞其转化效率最高,达到1.1×107,较15%甘油冻存保护剂保存的转化效率提高了69%。温浴5 min,冰浴10 min时,其转化效率最高,达到4.95×107。并且转化时间缩短至普通大肠杆菌感受态细胞的12.5%,仅为15 min。 2.试验以拟南芥为试材,设计特异引物克隆得到了拟南芥诱导型启动子rd29A的基因序列,通过在GenBank上进行核苷酸序列的比对,分析了该启动子的各个响应元件。结果表示,序列的第370-375碱基之间有5 bp的TATA盒(TATAA),在第737-744碱基间有8 bp的戴帽信号序列(TCAGTCTC),在第302-305和353-356碱基间有CAAT盒和富GC区域(ATGGGCCAATAG)。有文献曾经报道过的干旱响应顺式作用元件(DRE)(TACCGACAAT)这段序列位于第556-565碱基之间,而报道中的ABA响应元件(ABRE)(ACGTG)则位于第719-724碱基之间。 3.试验构建了诱导型植物瞬时表达载体PBI221-rd29A。通过分析启动子的酶切位点,试验利用HindIII和XbaI对启动子基因片段进行双酶切处理,同时载体PBI221也用相同的限制性内切酶进行酶切处理,将处理产物在T4 DNA连接酶的作用下16℃进行过夜连接,其产物转化大肠杆菌感受态细胞,经过培养得到含有载体质粒的克隆子。提取所构建载体的质粒进行酶切检测,顺利释放800bp左右目的条带,证明载体构建成功。同时本试验还构建了含有水通道蛋白AQP的瞬时表达载体PBI221-AQP,为验证AQP基因的功能奠定了基础。
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