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《西北农林科技大学》 2010年 硕士论文
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苹果褐斑病菌钙调素基因的cDNA克隆以及序列分析

杜雯林  
【摘要】: 苹果褐斑病(Marssonina coronaria)是引起苹果早期落叶病的主要病害之一。该病害主要危害苹果叶片造成大量落叶,贮藏期还能危害苹果果实,给苹果的产量和品质造成严重损失。苹果褐斑病病原分离难度大,因此苹果褐斑病的研究进展缓慢。目前大多数研究都仅停留在田间药剂防治方面,关于病原菌的基础研究,特别是分子生物学方面的研究还很少。 钙调素(calmodulin,CaM)基因在Ca2+信号转导系统中发挥着重要作用,并参与真菌的致病性调控过程。多相分析对于病害诊断和病原真菌分类是一个很好的工具,研究报道根据钙调素基因的内含子序列设计引物,通过PCR扩增和测序分析可以作为系统进化研究的依据。 本研究通过RT-PCR方法扩增苹果褐斑病菌CaM基因同源片段,经Blast后与GenBank中已知序列比对,设计特异引物,再通过SMART RACE方法进行扩增,得到了cDNA的3′端RACE和5′端RACE,长度分别为629bp和599bp,对所得序列进行拼接得到一个长为887bp的cDNA全长序列。通过NCBI上的ORF Finder分析可知该序列包括一个完整的编码框,长度为450bp,它编码149个氨基酸,编码框下游不存在终止密码子,在3′端有典型的Poly A尾。推导出的氨基酸序列与玉米大斑病菌、胶胞炭疽菌、稻瘟菌、核盘菌、疫霉的相似性分别为100%、100%、99.3%、98.6%、85.9%,显示该基因的高保守性。CaM基因属于EF-hand一族,BioEdit分析可知该基因的蛋白序列存在四个结合Ca2+的EF-hand结构域,其中包括保守氨基酸甘氨酸Gly和谷氨酸Glu。在这四个结构域中,苹果褐斑病菌CaM基因与胶孢炭疽菌(Colletotrichum gloeosporides)、玉米大斑病菌(Setosphaeria turcica)等其它菌一样,无论是保守氨基酸还是结构域序列均没有发生变异。根据所得的ORF设计特异引物,以DNA为模板进行扩增,得到了长度833bp的片段,序列分析可知该基因含有6个外显子和5个内含子,所有的外显子内含子边界特征均符合“GT-AG”的特点,在5个内含子序列中,除第四个内含子外,均含有套索保守序列CTRAY。在与其它真菌比较后发现苹果褐斑病菌内含子数量和位置均有所改变。 苹果褐斑病的症状复杂多样,本研究以所分离的苹果褐斑病菌16个菌株的DNA为模板,分别进行了CaM基因和ITS(内间隔转录区)序列扩增分析。结果表明,16个菌株的CaM基因序列共有7个变异位点,变异位点占总长的0.8%,其中6个位于内含子区域,有4个菌株发生了不同程度的变异,变异菌株率为25%;ITS的序列共有6个变异位点,变异位点占总长的1.0%,有9个菌株发生了不同程度的变异,变异菌株率为56.25%,16个菌株中有4个菌株两者都发生了变异。无论是变异的菌株数还是变异的位点,ITS均比CaM变异大,但相差不多,而且它们的这种变异均未能与症状统一起来,表明这种变异与它们的症状没有明显相关性。 采用直接挑取苹果褐斑病菌分生孢子的方法制备孢子悬浮液,用CaM基因特异性抑制剂三氟拉嗪(TFP)处理后发现,孢子的萌发数明显减少,说明其对孢子的萌发有一定的抑制作用。


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