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《西北农林科技大学》 2010年
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H9N2 AIV的NS1基因原核与真核表达及NS1蛋白对几种细胞凋亡的影响

刘红彦  
【摘要】: 禽流感(Avian Influenza, AI)是由正粘病毒科,流感病毒属,A型流感病毒引起的禽类感染和/或疾病的综合征。国际兽疫局(OIE)将禽流感定为A类传染病。H9N2亚型低致病性禽流感病毒在世界范围的禽群中广泛流行,感染鸡表现轻度的呼吸道症状和产蛋量下降,有报道称此病毒可以感染人引起流感样疾病。NS1是禽流感病毒唯一的非结构蛋白,在病毒复制及与宿主细胞蛋白的相互作用中发挥着重要作用,同时在鉴别诊断方面有较高的应用价值。本研究克隆并表达了一株H9N2亚型禽流感病毒陕西分离株(WN)的NS1基因,同时初步研究了NS1蛋白转染后对MDCK、Vero和293细胞凋亡的影响,为进一步研究NS1蛋白的功能及其与细胞相互作用的关系提供参考。 1.根据GenBank上已发表的H9N2亚型AIV的NS1基因序列,设计特异的引物,应用RT-PCR技术扩增H9N2亚型AIV陕西分离株(WN)的NS1基因,将其定向插入到原核表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-NS1,经IPTG诱导,在大肠杆菌中成功表达了分子质量约44 KD的NS1重组蛋白,Western-blotting分析显示,NS1基因表达产物能够与H9N2亚型禽流感多抗血清IgG反应,具有较好的抗原性和特异性。 2.应用PCR技术扩增出H9N2亚型AIV陕西分离株(WN)的NS1基因,将其与真核表达载体pEGFP-C1相连,构建重组质粒pEGFP-NS1,采用LipofectamineTM 2000脂质体转染法将pEGFP-NS1导入293细胞,并应用Western-blotting检测,得到55 KD的特异性条带,与预期结果相符,表明转染细胞中NS1蛋白得到成功表达,且具有良好的免疫学活性。 3.利用脂质体介导法将构建好的重组质粒pEGFP-NS1瞬时转染MDCK、Vero和293细胞。显微镜下观察可见转染NS1基因的细胞与正常细胞相比出现皱缩、体积变小、变形,脱落等凋亡形态。流式细胞仪检测发现NS1蛋白对MDCK和293细胞有促早期凋亡的作用,但不能促进Vero细胞的早期凋亡,实验表明,NS1蛋白是否诱导细胞凋亡与细胞的种类有关。
【学位授予单位】:西北农林科技大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2010
【分类号】:S852.65

【参考文献】
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