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《陕西中医药大学》 2019年
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益胃化瘀汤对PLGC小鼠胃黏膜STAT3/VEGF信号通路的影响及急性毒理学研究

谭育玲  
【摘要】:目的:通过采用KM小鼠按综合造模法(MNNG负荷灌胃雷尼替丁)建立慢性萎缩性胃炎胃癌前病变(PLGC)模型,观察益胃化瘀汤对小鼠一般情况及胃黏膜病理形态学的改变,并用免疫组化及实时荧光定量PCR(q PCR)检测STAT3、VEGF、CD31蛋白的表达及基因的转录情况,探讨其对PLGC治疗的分子生物学机理。同时对益胃化瘀汤进行急性毒性实验,以探讨益胃化瘀汤的安全性。方法:1.取60只SPF级雄性KM小鼠将其按随机数字表法,分为空白组9只和造模组51只。空白组每日给予0.9%氯化钠注射液按0.1ml/10g灌胃,至实验结束;造模组采用综合造模法造模12周后,随机处死2只,光镜下证实造模成功。将造模组余45只再次按随机数字表法分为5组,分别为模型组、叶酸组、中药大剂量组、中药中剂量组、中药小剂量组,分别给予0.9%氯化钠注射液、0.002g/Kg叶酸混悬液、20.54g/Kg中药、10.27g/Kg中药、5.14g/Kg中药,均按照0.1ml/10g灌胃,每天一次,连续8周。于第20周末禁食24h后取材,观察胃黏膜的病理变化情况,采用免疫组化法检测胃黏膜中STAT3、VEGF、CD31蛋白的表达情况,并计算MVD值;采用q PCR法检测胃黏膜中STAT3、VEGF、CD31基因的转录情况。2.取SPF级KM小鼠40只,雌雄各半,体重20±2g,随机分为2组,分别为给药组和空白组,每组20只,雌雄各半。禁食12h后,给药组给予以益胃化瘀汤的最大浓度(4g/ml)和最大容积(0.4ml/10g)灌胃2次,间隔8小时;空白组灌胃给予等容积的蒸馏水。服药后常规喂养,观察并记录给药后14天小鼠的情况。结果:1.益胃化瘀汤对PLGC小鼠胃黏膜STAT3/VEGF信号通路的影响实验中:1.1各组小鼠一般情况:造模期间造模组死亡4只;药物干预期间模型组、叶酸组各死亡2只,中药小剂量组死亡1只。空白组小鼠精神良好,皮毛光滑,活动灵活,双耳色淡红,食量较多,体重增长快,大小便正常;模型组小鼠精神差,皮毛粗糙,缺少色泽,活动少,双耳色泽苍白,食量少,体重增长缓慢,大便时干时稀,小便正常;叶酸组小鼠精神一般,皮毛欠光泽,活动度一般,食量较前增加,体重增长不明显,偶见大便稀;中药大、中剂量组小鼠精神相对模型组较好,皮毛稍有粗糙,活动相对灵敏,食量增加,体重增长,二便基本正常。中药小剂量组小鼠精神较差,皮毛粗糙,喜扎堆,偶见双耳色泽苍白,食量、体重稍有增长,但变化不明显。1.2各组小鼠HE光学显微镜观察:空白组:胃黏膜细胞排列整齐,连续且完整,细胞形态及大小正常,未见明显炎症细胞浸润等。模型组:胃黏膜上皮细胞萎缩、变薄,腺体数量减少,腺体结构紊乱,有炎症细胞浸润,形成淋巴滤泡,可见轻度肠化生的杯状细胞形成等。其余各治疗组与模型组相比,炎症细胞浸润较少,腺体结构相对规则,腺体数目逐渐增加,细胞形态比较均一,胃黏膜病变情况有逐渐好转趋势,其中以中药大剂量组尤为明显。1.3免疫组化法检测PLGC小鼠胃黏膜组织STAT3/VEGF通路相关蛋白的表达情况:与空白组相比,模型组STAT3蛋白、VEGF蛋白及CD31-MVD表达量升高明显,有统计学意义(P0.01)。与模型组相比,各药物治疗组STAT3蛋白表达量均明显下降,有统计学意义(P0.01)。与模型组相比,各药物治疗组VEGF蛋白表达量均降低明显,有统计学意义(P0.01)。与模型组相比,中药小剂量组CD31-MVD值降低,有统计学意义(P0.05);叶酸组、中药大剂量组及中剂量组CD31-MVD值降低明显,有统计学意义(P0.01)。1.4 q PCR法检测PLGC小鼠胃黏膜组织STAT3/VEGF通路的相关基因转录情况:与空白组相比,模型组STAT3m RNA、VEGFm RNA及CD31m RNA表达量均升高明显,有统计学意义(P0.01)。与模型组相比,叶酸组、中药大剂量及中剂量组STAT3m RNA表达量均降低明显,有统计学意义(P0.01)。与模型组相比,叶酸组、中药大剂量组VEGFm RNA表达量均降低明显,有统计学意义(P0.01)。与模型组相比,各治疗组CD31m RNA表达量均降低明显,有统计学意义(P0.01)。2.益胃化瘀汤的急性毒理实验中:2.1各组小鼠一般情况:各组小鼠一般状况良好,正常饮食饮水,皮毛柔顺,反应灵敏,活动自如,外观未见明显异常,大便成形,未见黑便等。各组小鼠至实验结束全部存活,未见死亡。2.2急性毒理实验中各组小鼠的体重在正式实验前1天、第1、3、7、14天相比差异无统计学意义。2.3急性毒理实验中各组小鼠的脏器指数均无显著性差异。2.4给予益胃化瘀汤灌胃的给药组小鼠检测不到半数致死率(LD50);小鼠的总药量为320g/Kg,相当于临床拟用量的243倍。结论:1.本实验通过采用MNNG负荷灌胃雷尼替丁的综合造模法复制PLGC模型,连续造模12周后光镜下病理证实造模成功。益胃化瘀汤可以改善小鼠的一般情况和胃黏膜的病理变化情况。同时通过益胃化瘀汤干预后,小鼠胃黏膜的STAT3、VEGF、CD31的蛋白表达及基因转录均明显降低,提示益胃化瘀汤可能通过抑制胃癌前病变的血管生成,降低胃癌发生的可能,从而改善了胃黏膜的病理状态,达到治疗PLGC的目的。2.益胃化瘀汤安全可靠。
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