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《陕西中医药大学》 2019年
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小檗碱调控miR-31-5p-Th17/Treg免疫网络治疗溃疡性结肠炎分子机制研究

唐梦凡  
【摘要】:目的:本研究旨在探究小檗碱(Berberine,BBR)对三硝基苯磺酸(2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid solution,TNBS)/乙醇(1:1)灌肠法诱导的溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)大鼠的治疗作用及其对辅助性T细胞17(T-helper cell17,Th17)/调节性T细胞(T Regulatory cells,Treg)免疫网络平衡的调节作用,以探讨BBR治疗UC可能的作用机制,为治疗UC提供实验依据。方法:大鼠采用TNBS/乙醇灌肠法建立UC模型,确认造模成功后,将50只大鼠采用随机数字表法分为柳氮磺吡啶(SASP,320mg/kg·d)组、模型(TNBS)组、空白对照(Control)组、小檗碱低剂量(BL,24mg/kg·d)组、小檗碱高剂量(BH,72mg/kg·d)组5组,Control组给予生理盐水灌胃,连续灌胃给药7d,给药剂量均为10mL/kg·d,实验期间密切观察并记录大鼠一般情况、大便情况、体重,评估疾病活动指数(disease activity index,DAI),治疗7天后,禁食1天,于第9天处死大鼠,腹主动脉采血并收集大鼠结肠组织,采用苏木精-伊红染色法(hematoxylin and eosin,HE)观察并评价结肠组织学评分(histological score,HS);采用酶联免疫吸附法(Enzyme-linked immunoadsorption assay,ELISA)测定血清中白介素(Interleukin,IL)-17A、IL-21、IL-10、转化生长因子β(TGF-β)的含量;采用蛋白免疫印迹(Western blot,WB)测结肠组织信号转导与转录激活因子3(Signal Transducers and Activators of Transcription 3,STAT3)、信号转导与转录激活因子3磷酸化蛋白(Phosphorylation Transducers and Activators of Transcription,P-STAT3)、维甲酸相关核孤儿受体γt(retinoid-related orphan nuclear receptor gamma t,RORγt)、STAT5、P-STAT5、叉状/翼状螺旋转录因子3(forkhead/winged helix transcription factor p3,Foxp3)的蛋白表达水平;采用实时荧光定量PCR(RNA Isolation and Real-Time Reverse Transcription Quantitative Polymerase Chain Reaction,Real-time PCR)检测结肠组织中miR-31-5p的mRNA表达水平。结果:1.大鼠一般情况及DAI指数表明:与Control组相比,TNBS组大鼠DAI指数明显增高(P0.01);经治疗,与TNBS组相比,各治疗组DAI评分均不同程度降低(P0.05或P0.01)。与DAY3相比,DAY7的SASP组、BL组及BH组DAI指数均明显降低,差异具有统计学意义(P0.05,非参数检验)。实验过程中Control组无死亡,TNBS组死亡1只,SASP组死亡2只,BH组死亡3只,BL组无死亡。2.大鼠结肠HE染色及HS评分结果表明:TNBS组光镜下可见黏膜充血、水肿,大量炎性细胞浸润,病变深度达全层,隐窝破坏或结构改变,腺体排列紊乱,部分表面上皮脱落。TNBS组结肠组织病理评分显著高于Control组(P0.01),各治疗组结肠组织病理评分低于TNBS组,以BH组尤甚(P0.05或P0.01)。3.大鼠血清ELISA结果表明:TNBS组大鼠IL-17A、IL-21含量明显高于Control组(P0.01),TNBS组大鼠IL-10、TGF-β含量明显低于Control组(P0.01),经药物干预后,各治疗组血清中的IL-17A、IL-21明显低于TNBS组(P0.05或P0.01);IL-10、TGF-β明显高于TNBS组(P0.05或P0.01)。4.大鼠结肠Western blot结果表明:与Control组相比,TNBS组STAT3、P-STAT3、RORγt均显著增高(P0.01),P-STAT5、Foxp3均显著降低(P0.01),STAT5与Control组相比差异无统计学意义(P0.05),经治疗,各治疗组STAT3、P-STAT3、RORγt含量与TNBS组相比均不同程度降低(P0.05或P0.01),STAT5、P-STAT5、Foxp3含量与TNBS组相比均明显增高(P0.05或P0.01)。5.大鼠结肠PCR结果表明:与Control组相比,TNBS组大鼠结肠miR-31-5p表达含量明显增高(P0.05),经药物干预后,各治疗组结肠miR-31-5p表达含量较TNBS组明显降低(P0.01),各治疗组之间无明显差异(P0.05)。结论:1.BBR能够缓解TNBS/乙醇诱导的UC大鼠症状,有一定的治疗作用。2.BBR可通过miR-31-5p-Th17/Treg免疫网络轴调控各种炎性因子、蛋白及miRNA表达,对TNBS/乙醇诱导的UC大鼠发挥治疗作用。
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