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《陕西中医药大学》 2019年
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红景天苷通过DJ-1/Akt通路保护多巴胺能神经元的实验研究

方艳  
【摘要】:目的:探讨Sal是否能通过DJ-1/Akt抗氧化通路在体内外发挥神经保护作用。实验一:建立MPP~+诱导的PD-MN9D细胞损伤模型,筛选出MPP~+处理MN9D细胞凋亡的最佳作用浓度和Sal对MPP~+诱导的PD细胞模型的最佳保护浓度。实验二、实验三:分别用siAkt和siDJ-1转染PD-MN9D细胞,探讨Akt和DJ-1在Sal对细胞模型的保护作用中的机制。实验四:建立MPTP诱导的C57BL/6小鼠PD模型,探讨Sal对小鼠模型行为学和神经组织学的影响。方法:实验一:CCK-8试剂盒检测细胞活力,分别筛选出MPP~+和Sal的最佳作用浓度;设立(1)空白对照组,(2)Sal组,(3)MPP~+组,(4)Sal+MPP~+组;Hoechst染色、流式细胞术检测不同处理组细胞形态学变化和凋亡水平;蛋白免疫印迹实验检测不同处理组细胞内DJ-1,Akt,p-Akt,GSK3β,p-GSK3β,cleaved-caspase3的蛋白表达水平。实验二、实验三:分别用siAkt和siDJ-1转染PD-MN9D细胞,设立(1)空白对照+scramble siRNA组,(2)MPP~++scramble siRNA组,(3)MPP~++Sal+scramble siRNA组,(4)MPP~++Sal+scramble siRNA+siAkt/siDJ-1组;Hoechst染色、流式细胞术检测不同处理组细胞形态学变化和凋亡水平;蛋白免疫印迹实验检测不同处理组细胞内DJ-1,Akt,p-Akt,GSK3β,p-GSK3β的蛋白表达水平。实验四:实验动物分组和模型制备:40只C57BL/6小鼠随机分为4组,10只/组,设立(1)正常对照组:连续腹腔注射生理盐水12天,1次/天;(2)Sal组:连续腹腔注射生理盐水5天后,改用Sal(45mg/Kg)腹腔注射7天,1次/天;(3)MPTP模型组:将MPTP(30mg/Kg)连续5天腹腔注射后,改用生理盐水腹腔注射7天,1次/天;(4)Sal+MPTP组:将MPTP(30mg/Kg)连续5天腹腔注射后,改用Sal(45mg/Kg)腹腔注射7天,1次/天;各组小鼠根据实验设计处理后,爬杆实验和悬挂实验进行行为学检测;检测后的小鼠进行脑组织取材固定和制备冰冻切片,免疫组化法进行各组小鼠中脑酪氨酸羟化酶(TH)和多巴胺转运体(DAT)免疫荧光染色,计数阳性神经元数目,观察Sal对MPTP诱导的小鼠模型中TH和DAT数目的影响;蛋白免疫印迹实验检测不同处理组细胞内DJ-1,Akt,p-Akt,GSK3β,p-GSK3β,cleaved-caspase3的蛋白表达水平。结果:实验一:不同浓度MPP~+(0、100、200、300、400、500μM)处理细胞24h,细胞活力以剂量依赖式降低,300μM MPP~+作为处理MN9D细胞24h的最佳浓度,用于后续细胞实验中;用不同浓度Sal预处理细胞24h后,加入终浓度为300μM MPP~+处理细胞24h,筛选出60μM的Sal能够明显降低MPP~+诱导的细胞活力下降;Hoechst染色后,Sal预处理能明显减轻MPP~+诱导的细胞形态变小,细胞核碎裂,染色质凝聚等情况(P0.05);流式细胞数检测出Sal预处理能显著降低MPP~+诱导的细胞凋亡数目比值(P0.01);Westen Blot技术检测出Sal预处理24h后,与MPP~+组比较,DJ-1,p-Akt/Akt,p-GSK3β/GSK3β表达水平增高(P0.05),Cleaved-caspase3表达水平下降(P0.05)。实验二、实验三:分别用siAkt和siDJ-1转染PD-MN9D细胞后,转染后都降低了Sal对MPP~+诱导的细胞形态变小、细胞核碎裂、染色质凝聚的保护作用(P0.05);siAkt转染后,Sal提高MPP~+诱导的p-Akt/Akt,p-GSK3β/GSK3β表达水平的作用受到抑制(P0.05),但没有抑制DJ-1的表达(P0.05);siDJ-1转染后,Sal提高MPP~+诱导的DJ-1,p-Akt/Akt,p-GSK3β/GSK3β表达水平的作用受到抑制(P0.05)。实验四:小鼠在腹腔注射MPTP后,开始出现尾巴直立,弓背,步态不稳,运动迟缓、减少等改变,症状随给药天数增加而加重,给予Sal腹腔注射后,症状逐渐改善。爬杆和悬挂实验中,与MPTP组比较,经Sal治疗后,爬杆时间缩短(P0.01),悬挂得分提高(P0.05);免疫荧光染色结果得出MPTP组与对照组比,TH和DAT阳性细胞数量显著降低(P0.01),Sal治疗后,TH和DAT阳性细胞数量明显升高(P0.05);Westen Blot技术检测不同组处理后小鼠中脑组织中相关蛋白的表达:与对照组比,MPTP模型组小鼠中脑组织中DJ-1,p-Akt/Akt,p-GSK3β/GSK3β表达水平下降,Cleaved-caspase3表达水平升高(P0.05),经Sal治疗后,DJ-1,p-GSK3β/GSK3β表达水平增高(P0.05),p-Akt/Akt表达水平增高,Cleaved-caspase3表达水平下降,但无统计学意义(P0.05)。结论:(1)Sal能够减轻MPP~+诱导的细胞活力降低,抑制凋亡,减轻细胞核碎裂等凋亡变化,提高DJ-1,p-Akt/Akt,p-GSK3β/GSK3β蛋白表达水平,抑制Cleaved-caspase3蛋白表达,发挥神经保护作用。(2)DJ-1和Akt以及调控的抗氧化酶参与了Sal对MPP~+诱导的细胞凋亡的保护作用,siAkt转染后没有明显影响DJ-1的表达,而siDJ-1转染后却明显影响Akt的表达,说明DJ-1可能是Akt的上游调节因子,调控Akt等抗凋亡蛋白,在氧化应激和神经元保护的调控中发挥重要作用。(3)Sal明显减轻小鼠运动失调症状,改善行为学异常行为,减轻小鼠中脑黑质TH和DAT神经元损伤数量而保护DA能神经元,Sal可能通过DJ-1/Akt通路发挥对MPTP诱导的小鼠模型的神经保护作用。
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