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《陕西中医药大学》 2019年
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基于何首乌炮制“时-效-毒”变化规律的肝损伤机制及物质基础研究

周欣  
【摘要】:目的本研究通过体内与体外实验。探讨了何首乌生品及不同炮制品“时(炮制时间)-效-毒”的相关性,采用HPLC技术、细胞流式仪并且结合血液生化指标、免疫组化及PCR技术,对何首乌生品及不同时间炮制品的主要成分以及一些相关性指标的变化进行研究,并为临床正确用药提供理论支持。方法1.采用HPLC的方法,用色谱柱:HYPERSIL GOLD AQ 5UM(250*4.6MM)COLUMN。甲醇为A相,0.1%的甲酸水为B相进行梯度洗脱,0~19min,10%~36%A,90%~63%B;19~30min,36%~71%A,63%~29%B;30~50min,71%~100%A,29%~0%B;50~60min,100%A。色谱柱温度:35℃;检测波长:254 nm;流速:1.0 ml/min;进样量为10μL的方法对何首乌不同炮制品中蒽醌类、没食子酸及二苯乙烯苷成分的含量进行检测。2.取42只SD大鼠,随机分成空白组、生首乌组、清蒸8h、清蒸16h、清蒸32h、清蒸48h、清蒸72h组共7组,每组6只。连续7天,每天2次,在最后一次灌胃2h后,腹主动脉取血,30min后3000r离心,取血清进行37℃灭活30min,并且微孔滤膜过滤,制备含药血清进行CCK-8以及细胞凋亡的检测。3.肝损伤组:取SPF级小鼠70只,随机分成空白组、生首乌组、清蒸8h、清蒸16h、清蒸32h、清蒸48h、清蒸72h组共7组,每组10只,称重,标记。各给药组给药剂量为12g/kg(相当于成人最大用量的60倍),0.2m L/50g,空白组给于等量的生理盐水,连续4周后,取血清与肝组织进行各项指标的检测。保肝组:取SPF级小鼠90只,随机分成空白组、模型组、阳性药组、生首乌组、清蒸8h、清蒸16h、清蒸32h、清蒸48h、清蒸72h组共9组,每组10只。除空白组外,每组小鼠皮下注射10%的四氯化碳花生油溶液,首次灌胃0.2m L/10g,之后每次灌胃0.1m L/10g,每隔两天进行一次造模,首次造模后,开始给药,给药剂量为6g/kg(相当于成人最大用量的30倍),0.2m L/10g,空白组和模型组给与等量的生理盐水,阳性药给与联苯双酯滴丸(200mg/kg),连续4周后,取血清与肝组织进行各项指标的检测。结果1.HPLC检测结果显示:生首乌中的蒽醌类成分及鞣质类没食子酸成分与制首乌比较含量较低,而二苯乙烯苷的含量较高。清蒸组的制首乌的大黄素、大黄素以及没食子酸4种成分含量大体上都会随着炮制时间的延长而升高,而只有二苯乙烯苷含量会随炮制时间的增加而降低。2.CCK-8的检测结果显示:与空白大鼠含药血清组比较,生首乌组、清蒸8h、清蒸16h、清蒸32h、清蒸48h、清蒸72h组的含药血清给与Hep G2细胞后,都会有明显的抑制作用,清蒸组与生首乌组比较,清蒸16h、32h、48h、72h组也具有统计学差异(P0.05)。3.细胞流式仪检测结果显示:各组都会出现不同程度的早期和晚期凋亡还有细胞坏死,空白大鼠血清组与胎牛血清组比较,无统计学差异(P0.05),说明10%的胎牛血清和15%的空白大鼠血清具有相似的功效。而生首乌组、清蒸清蒸8h、16h、32h、48h及72h组与空白组比较凋亡率都具有显著性差异(P0.01),清蒸组与生首乌组比较,清蒸各组都具有统计学差异(P0.01)。主要出现在AV+、PI-区域,说明清蒸组以及生首乌组的含药血清都会使Hep G2细胞产生不同程度的凋亡。4.肝损伤组血液生化指标检测结果显示:生首乌组及清蒸8h组的AST、ALT以及ALP的与空白组比较均升高(P0.01或P0.05),清蒸16h、32h及48h的ALP与空白组比较具有统计学意义(P0.05)。与生首乌组比较,清蒸16h、32h、48h及72h组的ALT具有统计学差异(P0.05),清蒸32h、48h和72h组的AST也具有显著性差异(P0.01),而清蒸72h组的ALP具有统计学意义(P0.05)。保肝组血液生化指标检测结果显示:模型组的AST、ALT及ALP与空白组比较均具有显著性差异(P0.01),阳性药与模型组比较也具有统计学意义(P0.05),而给于何首乌不同炮制品的各给药组的AST、ALT及ALP与模型组比较均没有显著性差异(P0.05),说明何首乌不同炮制品对四氯化碳造成的肝损伤的保护作用不明显。5.肝损伤组免疫组化指标检测结果显示:生首乌组的Caspase-3、Bcl-2以及NF-kbp65的表达量与空白组比较都有显著性差异(P0.01);清蒸8h组的Bcl-2表达量与空白组比较也具有显著性差异(P0.01),而Caspase-3以及NF-kbp65的表达量与空白组具有统计学差异(P0.05);清蒸16h、清蒸32h及清蒸48h组的Caspase-3表达量与空白组比较具有统计学意义(P0.05);清蒸16h及清蒸32h组的Bcl-2表达量与空白组比较具有显著性差异(P0.01)。与生首乌组比较,清蒸8h、16h、32h、48h及72h组的Caspase-3、Bcl-2以及NF-kbp65的表达量都具有统计学意义(P0.01,P0.05)。保肝组免疫组化指标检测结果显示:与空白组比较,模型组的Caspase-3、Bcl-2以及NF-kbp65的表达量都具有显著性差异(P0.01,P0.05),阳性药组与模型组比较,也都具有显著的升高和降低,有统计学意义(P0.01,P0.05)。而清蒸组以及生首乌组的各种指标的表达量与模型组比较都无统计学差异(P0.05)。6.肝损伤组药物代谢酶指标检测结果显示:给药组的CYP2E1、CYP3A及CYP1A2酶的表达量按照生首乌组8h组16h组32h组48h组72h组逐渐下降,与空白组比较均具有显著性差异(P0.01,P0.05);与生首乌组比较,清蒸组的48h及72h组的CYP1A2酶的相对表达量也具有统计学意义(P0.05)。保肝组药物代谢酶指标检测结果显示:三种亚型酶模型组与空白组比较均具有显著性差异(P0.01),阳性药与模型组比较也均具有统计学差异(P0.05),而其他给药组的三种酶的相对表达量均有下降的趋势,但与与模型组比较均没有统计学差异(P0.05)。结论1.何首乌生品及不同时间炮制品的蒽醌类成分以及没食子酸的含量会随炮制时间的延长而逐渐降低,而只有二苯乙烯苷含量会随炮制时间的增加而降低。因此,可以推断:炮制时间可以影响何首乌清蒸品中主要成分的含量。2.何首乌导致肝损伤的成分可能是二苯乙烯苷类。3.何首乌导致的肝损伤与炮制的时间呈负相关。4.何首乌导致的肝损伤机制可能是与调节药物代谢酶的途径有关。5.何首乌的肝损伤以及保肝作用于给药的剂量具有一定的相关性,剂量与毒性呈正相关。而保肝作用可能与剂量呈负相关。
【学位授予单位】:陕西中医药大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2019
【分类号】:R285.5

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