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《陕西师范大学》 2011年
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氯过氧化物酶催化氧化环烯烃的研究

张慧真  
【摘要】:氯过氧化物酶(Chloroperoxidase,CPO)因其独特的活性中心结构而具有多种多样的催化性能及广泛的底物适应性,目前被认为是血红素过氧化物酶家族中应用最广泛的酶。CPO活性中心与细胞色素P-450相似,其卟啉铁的第五轴向配位原子为半胱氨酸的巯基硫原子,但与细胞色素P-450不同的是CPO的催化循环无需辅酶,反应过程大大简化,是一种极具产业化应用潜力的生物催化剂。 小分子环烯烃是石油冶炼中常见的副产品,且产量很大。利用这种得天独厚的原料优势,开展“加氧”反应的研究以提高其利用价值进行下游产品的开发很有意义。因此,本文选择以环己烯、环戊烯为模型底物,以期建立一条CPO催化小分子环烯烃“加氧”转化的环境友好路线。 由于CPO是亲水性的,而疏水性的有机底物在反应体系中的难溶性导致底物与CPO无法有效接触,这是制约CPO在有机合成中的应用的一个主要瓶颈。本文基于有机溶剂的共溶剂效应及亲水性的咪唑/吡啶类离子液体(ILs)和亲水性季铵盐(QAS)的添加剂效应,通过溶剂工程调控和提高目标产物的产率,并以多种谱图表征结合反应动力学参数的测定研究了ILs及QAS对CPO活性中心微环境及蛋白结构的影响,以解析CPO催化活性改善的原因;同时基于聚电解质超分子自组装制备固定化的CPO生物活性超薄膜以实现CPO的重复使用。其主要结果如下: 1.环己烯体系:根据影响反应的因素对工艺条件(pH值、酶用量、氧化剂用量及反应时间等)优化后的环己烯的转化率及环氧环己烷的产率分别为44.5%和40.3%。在缓冲液体系(PBS)中引入亲水性咪唑/吡啶类离子液体(ILs)或者亲水性季铵盐(QAS)为添加剂时,含量仅为1.5%(WAdditive/WPBS)时环己烯转化率可分别提高31.0%和36.5%,酶促反应动力学参数Km,的减小以及Kcat和Kcat/Km的增大表明引入离子液体或季铵盐时CPO对底物的亲和力及对底物识别的专一性得以改善,导致转化数增大,这是底物转化率有效提高的主要原因;此外,紫外,荧光及圆二色谱研究及产物组成分析表明离子液体及季铵盐在反应体系中具有多重功能:相转移催化、诱导酶分子结构优化及调节产物组成,其中以四丙基溴化铵(TPABr)对CPO酶促反应的增敏效果最佳。由于反应基本在150 min内结束,酶用量极少,因此具有一定的产业化应用潜能。 2.环戊烯体系:通过选择最佳的氧化剂用量、pH、反应时间及酶用量优化了CPO催化氧化环戊烯反应的条件。鉴于在环己烯体系中引入亲水性离子液体和季铵盐时,在提高底物转化率的同时也会促使环氧化产物进一步水解为二醇,因此为了获得利用价值更高的目标产物:环氧环戊烷,本体系中引入了微溶于水的有机溶剂,以期通过有机溶剂的共溶剂效应,在改善底物转化率的同时提高目标产物的产率;但由于受到酶在有机溶剂中的稳定性的限制,环戊烯的转化率仅提高了12.4%,其中以引入乙酸戊酯为添加剂时对CPO酶促反应的增敏效果最好。 与所有的天然酶分子相同,CPO在酸、碱和有机溶剂,反应温度较高的极端条件下的稳定性差,且不能重复使用,很大程度的限制了CPO的产业化应用。因此开展了基于超分子自组装的方法氯过氧化物酶以表面阴离子化的聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)薄膜为基材自组装制备有序而稳定的生物超薄活性酶膜的研究,以CPO催化的2-氯-5,5-二甲基-1,3-环己烯酮(MCD)的氯化反应为酶膜活性的评价指标优化组装条件,同时以紫外-可见分光谱考察了PET基材上的组装过程,并以环境扫描电子显微镜对膜表面形貌进行了分析,并将超分子自组装固定化的CPO超薄活性膜分别应用于环己烯、环戊烯的环氧化体系中。
【学位授予单位】:陕西师范大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:O643.32

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