拟黑多刺蚁dpp基因的克隆与mRNA水平表达及其对发育影响的研究

【摘要】：dpp (decapentapletic)基因,属于转化生长因子(transforming growth factor beta,TGF-β)超家族,是昆虫发育过程中的关键基因,最早在果蝇中发现并进行研究。 拟黑多剌蚁(Polyrhachis vicina Roger),隶属于昆虫纲(Insecta)、膜翅目(Hymenoptera)、蚁科(Formicidae)、多刺蚁属(Polyrhachis),是群集而居的社会性昆虫,具备社会性昆虫的典型特征。同巢中世代重叠,有三个品级的蚂蚁-雌蚁(Female)、雄蚁(Male)和工蚁(Worker),品级间的分工非常明确,神经系统和行为高度复杂,因此是研究昆虫生长发育非常好的模式生物。 本实验以拟黑多刺蚁为研究对象,首先运用RT-PCR和RACE技术,获得拟黑多刺蚁dpp基因的全长cDNA序列：其次利用生物信息学技术对dpp基因进行核苷酸序列和蛋白序列分析、进化关系分析及功能预测；最后,采用实时定量PCR方法研究dpp基因在拟黑多刺蚁不同发育阶段个体和不同品级虫体中的mRNA表达情况。所获实验结果如下： 1.获得拟黑多刺蚁dpp基因的序列全长为1866bp,其中开放阅读框的长度为1644bp,编码547个氨基酸残基,3’非编码区长度(3’-UTR)为104bp,3’末端存在典型的加尾信号AATAA及序列长度为13bp的PolyA尾。5’非编码区长度(5’-UTR)为118bp。将拟黑多刺蚁dpp基因的全长cDNA序列命名为Pvdpp,并上传至NCBI的GenBank数据库,得到的序列号为JX021498。 2.同源性和系统发育分析显示,PvDPP蛋白序列与其它物种的dpp同源基因编码的蛋白序列相似度很高。理化性质分析显示dpp基因编码的蛋白分子量为61804.7Da,等电点为9.79,有一个典型的TGFβ结构域,属于亲水性的非分泌蛋白。二级结构分析显示该蛋白属于mixed型蛋白。三维结构分析显示,与该蛋白序列最匹配的模板是2h62B,序列一致性为81.55%,评价值为1.26e-50。 3.采用实时定量技术研究dpp基因在拟黑多刺蚁不同品级和不同发育阶段虫体中的mRNA表达情况,结果显示：dpp基因在拟黑多刺蚁的不同发育阶段和不同品级虫体中均有表达。在幼虫时期,以在一龄幼虫中的表达量最高,其次是三龄幼虫和蛹,在卵和二龄幼虫中的表达量相对来说较少,原因可能与dpp基因在胚胎发育过程中的功能有关。有研究证实,dpp基因可以决定昆虫附肢的发育位置,而且在体节形成过程中与间隔的形成有关。另外dpp基因还参与胚胎背腹轴的形成,因此对于昆虫的生长发育来说,dpp基因起着非常重要的作用,所以在拟黑多刺蚁的幼虫期dpp因的表达量较高。另外,在三个品级的成虫体内dpp基因的表达量也很高,但还是存在很大的差异,结果显示dpp基因在工蚁中的表达量最高,其次是雌蚁,在雄蚁中的表达量最少。出现这种现象的原因可能与工蚁复杂的社会功能有关,工蚁在蚁群中的职能非常多,它们不仅要打扫蚁巢,还要照顾雌蚁和幼蚁,与雌蚁和雄蚁相比,它们的社会功能更加复杂,因此推测dpp基因在工蚁复杂的行为调节中发挥着重要的作用。 本次研究首次从社会性昆虫-拟黑多刺蚁体内成功的克隆了dpp基因的全长cDNA序列,并将该序列上传至GenBank:利用生物信息学技术对dpp基因进行核苷酸和蛋白序列分析、进化关系分析及功能预测；同时通过实时定量技术研究发现,dpp基因在拟黑多刺蚁不同发育阶段和不同品级虫体中的表达量存在差异。这些研究结果可以使我们进一步了解dpp基因的结构和功能,在此基础上,可以进一步研究该基因对昆虫发育产生的作用和影响。