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拟黑多刺蚁谷氨酰胺合成酶GInS的克隆与mRNA水平对发育影响的研究

刘姣姣  
【摘要】:谷氨酰胺合成酶(Glutamine Synthetase,GInS)在生物体内特异地催化谷氨酸生成谷氨酰胺,是谷氨酸代谢的关键酶。该酶参与维持机体正常的神经传递,以及受损神经的修复,该酶变异将导致多种神经认知疾病发生。 拟黑多刺蚁(Polyrhachis vicina Roger)隶属于:昆虫纲(Insecta)、膜翅目(Hymenoptera)、蚁科(Fromicidae)、多刺蚁属(Polyrhachis),是由国家卫生部指定的可作为药食两用的昆虫。拟黑多刺蚁作为典型的社会性群居生活的昆虫,其主要的生活特性是具品级分化现象,社会行为相当复杂,群落内部分工十分明确。此外,该昆虫便于饲养、采样,虫体易于区分、提取,其神经系统高度复杂,是很好的用于研究昆虫生长发育、神经功能研究的实验动物材料。 本实验的研究材料采用拟黑多刺蚁不同品级、不同发育阶段的虫体,实验技术则采用巢氏RT-PCR、3'与5'RACE等克隆出GInS基因的全长cDNA;实验结果分析使用生物信息学方法预测表达产物蛋白质谷氨酰胺合成酶的结构和功能;应用荧光实时定量RT-PCR相对定量技术,研究谷氨酰胺合成酶mRNA在拟黑多刺蚁不同发育阶段及不同品级虫体之间的表达差异。研究结果如下: 1、拟黑多刺蚁谷氨酰胺合成酶GInS基因全长1396bp。最大的开放阅读框为1110bp,编码369个氨基酸,3’非编码区和5’非编码区长度分别为162bp和123bp,3’非编码区可见典型的加尾信号AATAA以及19bp的ploy(A)尾。将该基因命名为Pv-GInS,上传到NCBI网站,得到基因的序列号:JQ6790101。 2、运用生物信息学方法翻译出该基因所编码的氨基酸序列,得到预测的GInS蛋白,其分子量42.02kDa,等电点pI5.70。进行同源性分析显示,与其他真核生物物种,尤其是昆虫的谷氨酰胺合成酶GInS蛋白序列相似度75%左右。结构域分析预测显示该蛋白具有谷氨酰胺合成酶的功能区域,由此可判定获得的基因正是拟黑多刺蚁谷氨酰胺合成酶。 3、采用荧光实时定量技术,对拟黑多刺蚁不同发育阶段幼虫、不同品级成虫的Pv-GInS在mRNA水平上相对定量的表达研究。实验数据显示,所有被检样品中均有Pv-GInS的表达。在不同发育时期的幼虫中,一龄幼虫、二龄幼虫和蛹的表达量较高,相反,卵和三龄幼虫、四龄幼虫表达量较低。在不同品级成虫中,工蚁表达量最高,雄蚁比工蚁略少,雌蚁极少。


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