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铵盐和硝酸盐对中华大蟾蜍胚胎和幼体发育的毒性研究

陈婧  
【摘要】:氮是自然界中含量最为丰富的元素之一,其化合物广泛应用于生活中各个领域。随着工业的不断发展,大量的含氮化肥、畜牧养殖业产生的含氮污染物、人类生活以及工业产生的废水以径流的方式进入水体,造成水体内含氮污染物的浓度不断升高。在水生环境中,氮多以氨、铵盐、亚硝酸盐和硝酸盐四种形式存在。它们对水生生物的毒性依次是氨铵盐亚硝酸盐硝酸盐。铵盐和亚硝酸盐在水体中,可以通过细菌的作用氧化成硝酸盐;硝酸盐可以在水生动物胃肠环境中转化成亚硝酸盐。由此可知,它们之间存在着相互转换的关系。 两栖动物变态发育过程需要甲状腺系统进行调控。甲状腺素(T4)和3,5,3’-三碘甲腺原氨酸(T3)是甲状腺分泌的有生物活性的激素。T4可被II型脱碘酶(Dio2)作用转化成激活形式的T3。III型脱碘酶(Dio3)具有内周脱碘酶的活性,可以使T4和T3外环脱碘成为活性较低的激素。Dio2和Dio3在两栖动物体内通过催化作用调控甲状腺激素T4和T3的浓度,从而达到甲状腺激素对两栖类的生理和生化的调节作用。 研究发现,在“富氮”水域中出现了两栖类生物种群数量急剧下降的趋势。铵态氮和硝态氮被认为是水生生态系统中造成水体污染的主要污染源。为了研究铵态氮(NH4-N)和硝态氮(N03-N)对于两栖动物胚胎及幼体发育的具体影响,本研究以水体中常见的中华大蟾蜍的胚胎和幼体为实验材料,将其暴露在不同浓度的氯化铵(NH4C1)和硝酸钠(NaN03)溶液中,来检测药物对中华大蟾蜍胚胎和幼体生长发育的影响。本研究采用生物统计学方法、组织病理学方法、分子生物学方法等多种实验手段来检测NH4-N和N03-N对胚胎及幼体的毒性。主要的研究成果如下: 1.采用半静态生物毒性试验方法对中华大蟾蜍G20期的胚胎进行NH4-N和N03-N急性毒性试验,测定了NH4-N和N03-N对胚胎的半数致死浓度。结果显示NH4C1在96小时的半致死浓度(LC50)为768.430mg/L NH4-N,而暴露在NaNO323mg/L NO3-N。4天后,中华大蟾蜍的胚胎半致死浓度(LC5o)为978.8NH4-N、9.788mg/L NO3-N。根据我们的结果可推算出NH4C1和NaN03对中华大蟾蜍胚胎的安全浓度分别是7.684mg/L10mg/L、50mg/L和100mg/L的NH4-N和NO3-N 2.将胚胎分别暴露在浓度为G19。100mg/L的处理组。暴露时间是从胚胎的原肠中期阶段(G11)到鳃盖褶完成期阶段(G25)。结果显示,100mg/L的NH4-N可以抑制胚胎的发育,使其发育阶段停止到G18到的N03-N对胚胎发育进程影响不明显。说明NH4C1比NaN03对中华大蟾蜍胚胎发育进程的影响更为敏感。随着暴露时间的延长,高浓度的NH4-N和NO3-N (≥50mg/L)使胚胎的体重与全长降低;低浓度的NH4-N和NO3-N (10mg/L)对胚胎的体重与全长影响不明显。 3.组织学检测显示,胚胎暴露于不同浓度的NH4-N和N03-N呈现出个体偏小、体轴弯曲、胚胎腹部肿胀等畸形结果。G20期的胚胎长时间暴露于100mg/L的N03-N,可导致晶状体与视网膜的退化。胚胎的嗅上皮与黏附腺中的生黑素细胞增多。采用扫描电子显微镜检查法观测100mg/L的N03-N导致胚胎的腮和皮肤表皮出现不规则的波纹状突起结构。 4.采用半定量RT-PCR的方法,检测到100mg/L的NH4-N下调Dio2和Dio3基因表达。经100mg/L的N03-N暴露处理的胚胎,其Dio2和Dio3基因表达的表达水平与对照组相比差异不明显。采用原位杂交的方法检测NH4C1和NaN03对G20期胚胎的Dio2和Dio3基因的表达。结果显示Dio2mRNA在100mg/L的NH4-N处理组中主要分布于胚胎的脑部及体轴;Dio2mRNA在100mg/L的N03-N处理组中分布位置与对照组无明显差别,主要有眼、鼻、口器、鳃、体节及尾等部位;Dio3mRNA在100mg/L的NH4-N处理组中集中分布在腮弓和口器;与对照组相比,Dio3mRNA在100mg/L的N03-N处理组中未在脑部表达。 5.本研究将幼体暴露在浓度为10mg/L、50mg/L和100mg/L NO3-N的处理组。暴露时间是从幼体的后肢芽发育期(G26)到变态高峰期(G42)。结果显示,100mg/L的N03-N在幼体变态高峰期可使其体重与全长增加。低浓度处理组(≤50mg/L NO3-N)对幼体的体重与全长的影响效果不明显。此外,10mg/L的NO3-N与对照组相比降低了幼体变态率,并且延长了50%幼体达到变态高峰期的时间(T0.5)。暴露在100mg/L NO3-N的幼体,其达到变态高峰期的百分比与对照组相比上升,并且缩短了50%幼体达到变态高峰期的时间(To.5)。 6.采用组织病理学实验方法,检测到10mg/L的N03-N导致G42期的幼体甲状腺滤泡上皮细胞数量明显增加,并且伴随着部分胶体减少和胶体空泡增多。在幼体变态高峰期,对照组与其它处理组的甲状腺结构差异不明显。产生这种结果的可能原因是NaN03通过抑制甲状腺滤泡细胞上的钠碘转运体与碘分子结合,从而减少甲状腺激素产生。此时,在负反馈调控的机制下,促甲状腺激素(TSH)会大量产生,使甲状腺滤泡上皮细胞增生和肥大。 根据上述结果,我们可以得出铵态氮和硝态氮对中华大蟾蜍的胚胎及幼体发育过程会产生毒性效应。这为综合评价含氮污染物对水生生态系统的影响提供科学依据,以期为无尾两栖类生物的保护和水环境监测提供理论参考。


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