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《陕西师范大学》 2017年
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中华大蟾蜍早期骨化的发生机制研究及变态过程中肠道微生物菌群多样性的研究

白筱  
【摘要】:两栖类无尾目在变态过程中会发生一系列复杂的形态学和生理学变化,以适应其从水生幼体到陆生亚成体的生境转变。这些变化主要表现为尾部的吸收,四肢的发育,鳃的退化及肺的发育,同时肝脏、骨骼和肠道等器官组织也会发生不同程度的重塑。为了研究两栖动物在变态过程中肠道微生物菌群的变化特征;以及在骨骼发育早期过程中,软骨内骨化的特点及其分子机制。本试验以中华大蟾蜍幼体为研究对象,首先观察和测量了中华大蟾蜍幼体在不同发育时期个体和其肠道的形态学变化;对变态前期(Gosner stage 30,G30)、临近变态期(G38)、变态高峰期(G42)和变态完成期(G46)中华大蟾蜍肠道微生物菌群的16S rDNA V3-V4区域进行测序,从而得出不同发育时期肠道微生物菌群的多样性的分布特征。同时对中华大蟾蜍后肢骨、脊柱的软骨和骨骼进行组织学染色研究,观察其在变态过程中的发育变化,并利用转录组测序和实时定量PCR技术研究不同发育时期(G30、G37、G42和G46)中华大蟾蜍软骨内骨化相关基因的表达特征,从而了解在变态过程中骨骼发育的分子机制。主要研究结果如下:1、形态学数据显示:中华大蟾蜍蝌蚪及其肠道发育在G26-G38期逐渐完善,但是从G38期至G46期,逐步退化。变态过程中,中华大蟾蜍的平均体重、体长、肠道重量和肠道长度分别减少了 56.8%,29.8%,91.8%和91.8%。2、通过对肠道微生物16S rDNA测序,从G30,G38,G42和G46期中华大蟾蜍幼体的肠道内容物中共获得了 267种分类操作单元(Operational taxonomic units,OTUs),差异的OUT分布和肠道微生物α-多样性表明,随着变态的发生,中华大蟾蜍蝌蚪肠道中微生物的多样性减少。3、对比四组样品肠道微生物β-多样性表明,中华大蟾蜍蝌蚪变态过程中,其肠道微生物组成发生变化。在G30和G38期蝌蚪肠道微生物组成较为相似,优势菌群主要有变形菌门和厚壁菌门,在G42和G46期蝌蚪肠道微生物组成较为相似,但其优势菌群主要为拟杆菌门、变形菌门、梭杆菌门和厚壁菌门。中华大蟾蜍蝌蚪从G38到G46期,肠道微生物菌群呈现很大变化:变形菌门的丰度降低,厚壁菌门内的细菌种类发生变化,拟杆菌门和梭杆菌门的丰度提高了,放线菌门基本消失,新出现了疣微菌门。4、相关性热图分析表明中华大蟾蜍蝌蚪肠道微生物改变和形态学参数改变之间存在潜在的联系。中华大蟾蜍体重、体长、全长、肠道长度和重量均与肠杆菌属和黄杆菌属呈正相关关系。在变态过程中,中华大蟾餘肠道微生物的Akkermansia菌、肠杆菌属、双歧杆菌属和Alpinimonas菌均和蝌蚪体重的减少有关。5、骨骼染色结果显示:中华大蟾蜍蝌蚪随着变态的发生其肢骨和脊椎骨骨化程度呈递增趋势。股骨骨化起始于G38期,骨化比例从最初的29%增加到G43期的 84%。6、经转录组测序共获得四个发育时期中华大蟾蜍蝌蚪共118,385,689个有效读长(Clean Reads)和137,264个非重复序列(Unigenes),其中约32.08%序列与已知蛋白相匹配。通过构建差异表达基因库,发现中华大蟾蜍蝌蚪在四个发育时期共存在 10,350 个差异表达基因(Differentially expressed genes,DEGs),归属为 8种不同的表达模式。7、通过比较分析差异表达基因和Nr数据库,识别了与软骨内骨化有关的28个基因,它们在不同的发育时期对甲状腺激素介导的软骨内骨化起不同作用。采用实时定量PCR验证了其中10个基因的表达水平,结果与转录组测序结果一致。综上所述,中华大蟾蜍在变态过程中,其肠道微生物种群多样性会减少,种群组成也会发生变化。这一阶段肠道微生物菌群的变化与其采食、生活环境、肠道形态和体重降低等变化有关。同时,中华大蟾蜍在变态过程中,其肢骨和脊椎骨骨化程度呈递增趋势,软骨内骨化相关基因差异表达分析证实了至少28个基因参与软骨发育。这些结果对进一步研究两栖类变态过程中肠道微生物种群多样性变化及一些与软骨内骨化相关基因的表达特征具有重要的参考意义,也为两栖类的保护和繁育提供实验参考。
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