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《陕西师范大学》 2018年
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基于转录组的镉胁迫杂拟谷盗的响应机制研究

柴青香  
【摘要】:随着工业的快速发展,越来越多的重金属镉被排放到了农业生态环境中,这些镉可能会逐渐积累到昆虫体内,对其产生一定的毒性效应。昆虫作为全球生物多样性中的关键组成部分,其作用不可小觑,因此越来越多的人们开始密切关注重金属镉对昆虫的毒性效应。昆虫摄取过量的镉会影响其生长发育。重金属镉在昆虫体内的积累过程是连续、动态的,其累积水平高低受昆虫被胁迫时间的长短、取食量的多少以及昆虫排泄镉的能力所影响。杂拟谷盗作为常见且危害严重的储粮害虫,目前对其已有的研究主要集中在借助传统手段而进行的形态学、生态学以及防治措施等方面,而基于全基因组和转录组水平的研究未见报道。本研究将杂拟谷盗作为实验对象,通过饲喂其含镉的饲料,研究了不同浓度镉胁迫对杂拟谷盗生长发育的影响以及杂拟谷盗在不同发育时期体内的镉含量,并通过Illumina Hiseq X Ten平台进行转录组测序,探究了镉胁迫引起的杂拟谷盗基因表达量和相关代谢通路的变化,来对镉引起杂拟谷盗的分子响应机制进行了阐述。最后利用qRT-PCR对从转录组数据中选出的8个差异表达基因进行了表达量的验证。本研究不仅提供了杂拟谷盗转录组信息资源,同时有助于更好的理解重金属镉的生态毒理学效应。本研究的主要结论如下:1.将三龄杂拟谷盗幼虫置于含有不同镉浓度的饲料中,饲喂10d后,观察发现,镉含量较高的组(实验组4和5)对杂拟谷盗幼虫体重增长率、蛹重、蛹长、化蛹率的影响较为显著(P0.05)。总体来看,随着饲料中镉浓度的不断升高,杂拟谷盗幼虫体重增长率、蛹重、蛹长、化蛹率呈现逐渐下降的趋势,但镉含量较低的组(实验组1、2和3)对杂拟谷盗幼虫体重增长率、蛹重、蛹长、化蛹率的影响不显著(P0.05)。2.将三龄杂拟谷盗幼虫置于含有不同镉浓度的饲料中进行饲喂,得到重金属镉在同一发育时期的杂拟谷盗体内的累积情况为:随着饲料中镉浓度的升高,在各实验组杂拟谷盗体内镉的积累量均显著高于对照组(P0.05)且各实验组杂拟谷盗体内镉的积累量之间存在显著差异(P0.05)。在经同一实验组胁迫杂拟谷盗后,虫体内镉含量随着处理时间的延长有明显积累,在胁迫3d和10d后,幼虫体内镉含量存在显著差异(P0.05)。杂拟谷盗在蛹期的镉含量与幼虫期相比显著下降(P0.05)。杂拟谷盗在初羽化时,成虫体内镉含量与蛹期相比又有所减少(P0.05)。杂拟谷盗成虫在初羽化到羽化后第7d,随着时间的延长虫体内镉含量显著降低(P0.05)。3.通过对杂拟谷盗两组不同处理(对照组和实验组4)共6个样品进行转录组测序,获取了 42.77 Gb clean data,其中Q30碱基百分比大于87.95%,GC含量为40%左右。通过拼接和组装后,共获得84,404条All-Unigene,N50为1,579 bp,平均长度为927.80 bp。将得到的84,404条杂拟谷盗All-Unigene进行功能注释,一共有 32,013 条(37.93%)All-Unigene 得到了注释,其中在 COG、GO、KEGG、KOG、Pfam、Swissprot、eggNOG、NR数据库中分别有 11,149、13,775、12,678、19,497、22,410、15,256、26,991、28,137 条 All-Unigene 得到了注释。在与 NR 数据库做比对时,All-Unigene的注释结果显示与赤拟谷盗(Tribolium castaneum)的匹配率是最高的,为43.06%。通过对杂拟谷盗All-Unigene的分析,一共得到了65,454个CDS,其分布在100-300bp的序列最多,有21,786条,占总量的比例为33.28%;分布在2,000 bp之上的序列数量最少,有4,013条,占总量的比例为6.14%。4.本研究在两组样品间共计筛选出4,250个差异表达基因,经GO功能注释结果显示共有1,529个得到注释:在生物学过程、细胞组分、分子功能这三大类中,注释出来的差异基因数目分别为1,288、594、1,319个。对两组样品间的差异表达基因进行KEGGpathway分析显示:一共有1,198个差异表达基因得到注释,涉及了 233条代谢通路。其中显著富集的通路有核糖体、内质网上蛋白质的加工、糖酵解、氧化磷酸化、过氧化物酶体、ABC转运体等。5.进一步对几条重要的富集pathway分析发现,在氧化磷酸化通路中,多个与电子传递链复合体相关的基因表达发生了上调,促进了产能增加,这种细胞内能量消耗可能与镉的排泄和杂拟谷盗虫体损伤修复有关。本研究中杂拟谷盗受镉胁迫后幼虫体重增长率显著降低,可能是由于这种异常的能量代谢所导致的。在内质网上蛋白质的加工通路中,Hsp70、Hsp40、Hsp90等基因表达上调,所以推测HSP基因可能是杂拟谷盗的一类重要的镉胁迫应答基因,在镉胁迫修复路径中起着至关重要的作用。在ABC转运体代谢通路中,ABCB、ABCC、ABCD和ABCG这些转运蛋白相关基因同时表达上调,ABC转运蛋白与节肢动物的抗性有关,这可能是ABC基因家族在本研究结果中表达显著上调的原因。6.利用qRT-PCR进行了 8个差异表达基因表达量的实验验证。结果表明qRT-PCR结果与RNA-Seq结果基本一致,证实了转录组数据的可靠性。
【学位授予单位】:陕西师范大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:S379.5

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