收藏本站
《陕西师范大学》 2018年
收藏 | 手机打开
二维码
手机客户端打开本文

丹参转录因子SmLBD23和SmLBD16的克隆及功能研究

冯书超  
【摘要】:丹参(Salvia miltiorrhiza Bunge),唇形科鼠尾草属药用草本植物,以其干燥根和根茎入药,含有多种有效活性成分,如丹参酮、隐丹参酮、迷迭香酸、丹参素、丹酚酸等,具有抗菌消炎、抗氧化、抗高血脂、抗肝损伤、抗纤维化、抗动脉粥样化、抑制癌细胞生长等药理活性,临床上有悠久的入药历史。由于传统中药是以水煎服的用药方式,所以水溶性的丹酚酸类成分被认为是发挥药效的主要活性物质,因此提高丹参中酚酸类成分的含量具有重要的意义。酚酸类成分作为丹参的次生代谢产物,受多种内外因素的影响,之前的研究表明:1.通过对丹酚酸合成途径上的单个酶基因进行修饰以达到提高丹酚酸类成分的目的的效果并不好。2.一些转录因子如MYB/bHLH家族类成员可以通过调控多个酶基因来影响次生代谢物的产量。LBD作为转录因子在调控植株生长发育和代谢方面有重要作用,前期研究发现LBD基因在丹参中存在潜在的调控丹参次生代谢的可能性,因此对丹参LBD基因的研究非常有意义。主要研究内容和结果如下:1.从丹参的基因组库中克隆得到两条LBD基因家族的Ⅱ类成员,通过同源比对和进化树分析归类,分别命名为SmLBD23和SmLBD16,其中SmLBD23含有一个长度为588bp的开放阅读框,编码195个氨基酸,SmLBD16含有一个长度为747bp的开放阅读框,编码258个氨基酸。它们的编码产物中均含有100个氨基酸残基左右组成的保守区一LOB结构域,属于DUF260超家族。蛋白亚细胞定位预测显示SmLBD23和SmLBD16均定位于细胞核,没有跨膜结构域,没有信号肽。表明二者不具有定向运输的结构基础,不是外泌蛋白,作为转录因子,主要在细胞核内发挥作用。另外通过对这两个基因的启动子区的顺式作用元件进行分析发现含有多种信号响应元件,如光响应元件Box 4、TCT-motif和TCCC-motif、赤霉素响应元件TATC-box、茉莉酸甲酯响应元TGACG-motif、水杨酸响应调控元件TCA-element。另外还含有植物生长激素响应元件、低温响应元件和干旱诱导元件。除此之外,还含有MYC结合位点、MYB结合位点等元件。2.分离纯化得到了数量够多,活性较好的拟南芥原生质体,并且构建得到SmLBD23和SmLBD16的亚细胞定位载体,通过PEG介导的化学转化方法将定位载体转入到拟南芥原生质体中,发现SmLBD23和SmLBD16都定位在细胞核,与预测结果一致,符合这两个基因作为转录因子在细胞核中发挥作用的特点。3.通过Gateway和amiRNA技术分别构建了SmLBD23和SmLBD16的过表达载体和干涉载体,通过根癌农杆菌介导的丹参叶盘转化法获得了SmLBD23的过表达植株和SmLBD16的干涉植株,(从DNA水平和RNA水平同时得到验证的阳性植株)并且对这两个转基因植株的叶和根中的花青素,总酚酸和总黄酮的含量进行了检测,发现:与对照相比,SmLBD23过表达株系中花青素含量有不同程度的降低,SmLBD16干涉株系中花青素含量有不同程度的升高,SmLBD23过表达株系中总酚酸含量有不同程度的降低,SmLBD16干涉株系中总酚酸含量有不同程度的升高,SmLBD23过表达株系中总黄酮含量在叶和根中有不同程度的变化,在叶中普遍提高,在根中普遍降低。SmLBD16干涉株系中总黄酮含量在植株的叶和根有不同程度的变化,在叶中普遍降低,在根中普遍提高。与过表达SmLBD23的结果正好相反。4.采用HPLC对丹参SmLBD23过表达株系和丹参SmLBD16的干涉株系进行丹参酮类成分和丹酚酸类成分的检测发现:与对照相比,SmLBD23过表达株系的迷迭香酸含量有不同程度的降低,而丹酚酸B,隐丹参酮,丹参酮ⅡA的含量并无明显变化。SmLBD16干涉株系中迷迭香酸含量有不同程度的升高,丹酚酸B,隐丹参酮,丹参酮Ⅱ的含量并无明显变化。我们选取了酚酸类物质合成途径上的18个酶基因和花青素合成的3个酶基因,另外还选取了一个MYB类转录因子SmPAP1,在转基因植株中进行表达量的检测,结果显示:丹酚酸合成途径的关键酶基因在丹参SmLBD23的转基因株系中的表达量发生了不同程度的改变,与对照相比,TAT1、TAT2、TAT3、PAL2、C4H2、4CL1、HCT1 和 HCT2 的表达量有明显的降低,其它的酶基因无明显变化。其中PAL2、C4H2和4CL1属于苯丙烷途径,是花青素合成和酚酸类合成的共有上游途径。花青素合成途径的关键酶基因CHS、F3'5'H和FLS的表达量有明显的降低,转录因子SmPAP1的表达量无明显变化。在SmLBD1 的干涉株系中,HPPR1、PAL1、PAL3、C4H1、4CL2 和 RAS 的表达量有明显的升高,其它的酶基因无明显变化。其中PAL1、PAL3、C4H1和4CL2属于苯丙烷途径,是花青素合成和酚酸类合成的共有上游途径。花青素合成途径的关键酶基因CHS、F3'5'H和FLS的表达量无明显的变化,转录因子SmPAP1的表达量有明显提高。猜测可能由于花青素合成途径的上游苯丙烷代谢的酶基因发生变化才引起的花青素含量的变化。而且这种变化很有可能和转录因子SmPAP1的调控有关系。5.SmLBD23和SmLBD16在丹参根茎叶花中均有表达,但表达水平有明显的差异,在叶中的表达量最高,其次是根,在茎和花中的表达量相对较低,说明这两个基因有可能在叶中发挥重要功能,与前面这两个基因影响酚酸类合成的作用是一致的。丹参在MeJA处理后,SmLBD23和SmLBD16的表达量有不同程度的变化,其中,SmLBD23基因的表达量在1h时达到最高,随后逐渐降低,SmLBD16基因的表达量存在2个峰值,分别是在1h和4h。结果表明,SmLBD23和SmLBD16在丹参中响应茉莉酸信号,参与茉莉酸信号通路。相较于对照,SmLBD23和SmLBD16在过表达SmMYC2的过表达株系中的表达量是明显提高的,说明这两个基因和SmMYC2是有一定关联的,而SmMYC2在茉莉酸信号通路中发挥一定作用,猜测SmLBD23和SmLBD16也在其中发挥作用。SmLBD23在过表达SmJAZ1的株系中的表达量是升高的,在过表达SmJAZ8的株系中是降低的,在jas保守结构域的干涉株系中是升高的。SmLBD16在过表达SmJAZ1的株系中的表达量是升高的,在过表达SmJAZ8的株系中是降低的,在jas保守结构域的干涉株系中是降低的。SmJAZs蛋白在茉莉酸信号通路中是负调控蛋白发挥重要作用,而SmLBD23和SmLBD16的表达受SmJAZs表达的影响,说明它们之间有关联,很可能共同参与茉莉酸信号通路,共同调控丹参次生代谢途径。酵母双杂结果显示,SmLBD23和SmJAZ1、SmMYB36、SmbHlH37、SmMYB97、SmMYC2b 均存在蛋白互作,说明它们在丹参植株内有可能是共同发挥作用或者是以蛋白复合体的形式起作用,需进一步试验验证。
【学位授予单位】:陕西师范大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:Q943.2;S567.53

【参考文献】
中国期刊全文数据库 前9条
1 苏酩;苗建武;田景振;;丹参有效成分的提取纯化研究[J];齐鲁药事;2010年09期
2 蒋科技;皮妍;侯嵘;唐克轩;;植物内源茉莉酸类物质的生物合成途径及其生物学意义[J];植物学报;2010年02期
3 张长贵;董加宝;王祯旭;;原花色素及其开发应用[J];四川食品与发酵;2006年01期
4 杨宏,韩树欣;丹参的鉴别[J];时珍国医国药;2004年07期
5 董浩迪,钟建江;诱导促进中国红豆杉细胞培养中紫杉烷的积累[J];华东理工大学学报;2002年01期
6 张军,刘璐,赖小平,刘良;丹参制剂的研究现状及对其开发的几点思考[J];中草药;2001年10期
7 李建秀,孙秀霞,周凤琴,李静,王少杰;山东丹参类药用植物新资源[J];山东中医学院学报;1995年03期
8 蔡朝晖,高山林,徐德然;丹参组织培养快速繁殖技术的研究[J];中国药科大学学报;1991年02期
9 董忠信;;丹参芦头繁殖方法[J];中草药;1990年03期
中国博士学位论文全文数据库 前1条
1 秦秋琳;银杏中与木质素合成和苯丙氨酸代谢相关的转录调控因子的克隆与研究[D];复旦大学;2007年
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 王名雪;长春花茉莉酸生物合成途径关键酶基因的克隆与表达分析[D];上海交通大学;2013年
【共引文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 马琛;汪雷;叶德;徐涛;;基于高通量测序的半夏变异珠芽转录组分析[J];浙江农业科学;2018年10期
2 闫小飞;张富军;杜小娟;武丽涛;李冬民;韩燕;;丹参素通过激活Wnt/β-catenin通路促进大鼠原代成骨细胞的分化[J];西北药学杂志;2018年05期
3 李秋利;高登涛;魏志峰;王志强;刘军伟;杨文佳;;不同浓度茉莉酸甲酯对春蜜桃果实品质的影响[J];浙江农业学报;2018年06期
4 张怀辉;杨晓云;杨勇;刘静;周文忠;马香艳;侯英;;温度对不同花期双色茉莉花香味成分的影响研究[J];云南化工;2018年06期
5 李秋利;高登涛;魏志峰;王志强;刘军伟;杨文佳;;茉莉酸类物质对“映霜红”桃果实品质的影响[J];中国南方果树;2018年03期
6 贾宏丽;周良云;王升;刘亚辉;莫歌;郭兰萍;;茉莉酸通路参与Hpa1诱导的欧洲花楸细胞植保素生物合成[J];中国中药杂志;2018年14期
7 Qi WU;Pingsheng LENG;Zenghui HU;;Cloning and Expression Analysis of Allene Oxide Synthase Gene Ls AOS in Lilium ‘Siberia'[J];Agricultural Biotechnology;2018年02期
8 杜维;丁健;阮成江;;沙棘果实发育过程中内源激素水平的动态变化[J];植物学报;2018年02期
9 郭朦朦;陈慧洁;冯丽贞;杨泽慧;陆芝;唐芬;;茉莉酸甲酯诱导桉树对焦枯病的抗性研究[J];江西农业大学学报;2018年01期
10 董先娟;李铁铮;冯莹莹;王晓晖;高博闻;;白木香丙二烯氧化物环化酶基因(AsAOC1)的克隆与表达分析[J];药学学报;2018年03期
中国博士学位论文全文数据库 前2条
1 董婧;基于转录组学的高丹草杂种优势研究[D];内蒙古农业大学;2017年
2 杨懋勋;野生白木香叶中的黄酮类化合物、抗癌活性及对伤害诱导结香化学干预作用初步研究[D];暨南大学;2016年
中国硕士学位论文全文数据库 前2条
1 冯书超;丹参转录因子SmLBD23和SmLBD16的克隆及功能研究[D];陕西师范大学;2018年
2 邹丹丹;黄瓜响应低氮胁迫基因CsAOC3的克隆和功能分析[D];东北农业大学;2017年
【二级参考文献】
中国期刊全文数据库 前10条
1 王桂花;周峰;任中楠;杨屹;;微波辅助萃取与超声波萃取丹参中丹酚酸B的比较研究[J];分析科学学报;2009年05期
2 金承怀;罗杰英;袁洪;谭鸿毅;刘畅;黄志军;阳国平;;超临界二氧化碳萃取丹酚酸B的提取工艺研究[J];时珍国医国药;2009年07期
3 左照江;张汝民;高岩;;植物间挥发物信号的研究进展[J];植物学报;2009年02期
4 谢静;;丹参水溶性成分提取工艺研究[J];中国药业;2009年03期
5 韩晓珂;刘汉清;张明;马俊华;马继永;;SFE-CO_2与渗漉法提取丹参药渣中脂溶性成分比较[J];医药导报;2009年02期
6 瞿礼嘉;王小菁;王台;杨维才;许亦农;袁明;蒋高明;孔宏智;种康;;2007年中国植物科学若干领域重要研究进展[J];植物学报;2009年01期
7 张明;刘汉清;韩晓珂;马俊华;马继永;;SFE-CO_2和超声法提取丹参药渣的对比研究[J];中国中医药信息杂志;2008年12期
8 吴婉莹;杨洲;侯晋军;果德安;;总丹参酮不同纯化工艺的比较[J];中草药;2008年12期
9 贺建东;付廷明;郭立玮;;丹参脂溶性成分的湿式超微粉碎提取[J];时珍国医国药;2008年11期
10 陈殿伟;魏庆玲;孙秀利;;微波法提取丹参中丹参酮ⅡA[J];中成药;2008年07期
【相似文献】
中国硕士学位论文全文数据库 前1条
1 冯书超;丹参转录因子SmLBD23和SmLBD16的克隆及功能研究[D];陕西师范大学;2018年
中国知网广告投放
相关机构
>陕西师范大学
相关作者
>冯书超
 快捷付款方式  订购知网充值卡  订购热线  帮助中心
  • 400-819-9993
  • 010-62791813
  • 010-62985026