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《陕西师范大学》 2018年
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植物乳杆菌对氨基糖苷类抗生素耐药性的研究

高佳媛  
【摘要】:植物乳杆菌作为食品和医疗行业中常用的益生菌,具有很大的食用和药用价值。但是,大多数乳酸菌的耐药性都存在潜在的可转移性,会对机体健康产生不利影响,因此在应用前必须对其进行耐药安全性的评价。鉴于此,本研究选用植物乳杆菌ATCC14917,在氨基糖苷类抗生素选择压力中筛选具有高耐药性的菌株,研究高耐药植物乳杆菌ATCC14917进化过程中表型特征,结合全基因组测序技术,在分子水平探究植物乳杆菌ATTCC14917耐药机制以及与耐药性相关基因的转移性,初步评估了植物乳杆菌ATTCC14917对氨基糖苷类抗生素的耐药安全性。首先,研究了植物乳杆菌ATCC14917对氨基糖苷类抗生素的耐药性。采用宏量稀释法测定植物乳杆菌对氨基糖苷类抗生素的耐药性,结果表明,植物乳杆菌ATCC14917原始菌株对链霉素、新霉素、庆大霉素和卡那霉素的MIC值分别为16μg/mL、32 μg/16 μg/mL和64 μg/mL,除对链霉素耐药外,植物乳杆菌ATTCC14917对新霉素、庆大霉素和卡那霉素均敏感。为了深入研究植物乳杆菌ATCC14917对氨基糖苷类抗生素耐药安全性,采用实验室进化构建高耐药菌株。进化实验结束时,植物乳杆菌ATTCC14917对链霉素、新霉素、庆大霉素和卡那霉素的 MIC 值分别增长到 131072μg/mL、256 μg/mL、512 μg/mL 和 1024 μg/mL,耐药性分别是原始菌株的8192倍、64倍、128倍和64倍。将高抗链霉素、新霉素、庆大霉素和卡那霉素植物乳杆菌ATCC14917分别接种至不含抗生素的培养基中传代30天,发现植物乳杆菌ATTCC14917对链霉素的耐药性从131072 μg/mL降低到4096 μg/mL,对新霉素的耐药性从256 μg/mL降低到32 μg/mL,对庆大霉素的耐药性降低到64 μg/mL,对卡那霉素的耐药性降低到128 μg/mL,去选择压力后植物乳杆菌耐药性下降,但MIC值仍高于耐药临界点,表明耐药性的获得是一个不可逆的过程。其实,研究了植物乳杆菌ATCC14917在进化过程中的表型特征稳定性。在植物乳杆菌ATTCC14917的进化实验中,对植物乳杆菌ATCC14917耐药性获得过程和去选择压力进化过程中菌株细胞形态、菌落形态、活菌数、菌体密度和发酵活力进行研究,结果表明高耐药性获得和连续传代过程中,植物乳杆菌ATCC14917的细胞形态和菌落形态没有改变,生长周期末的活菌数和菌体密度也没有变化,菌株发酵活力保持良好。在耐药性获得和和去选择压力进化过程中,植物乳杆菌ATCC14917具有较好的表型特征稳定性。最后,对植物乳杆菌ATC14917进行了全基因组分析。通过对不同传代条件下的菌株进行全基因组重测序,分析植物乳杆菌ATCC14917在氨基糖苷类抗生素压力和去选择压力下适应性分子机制。采用CLC Genomics Workbench软件分析传代过程中与耐药性有关的基因突变,通过Sanner测序验证突变基因,共检出6个非同义突变,包括2个SNP、1个MNV和3个SV。其中,植物乳杆菌ATCC14917的GL379762染色体385923位置检出了核糖体蛋白S12(ribosomal protein S12),在GL379762染色体的355220-355227位置检出了药物转运蛋白MFS,这两种蛋白在四种抗生素传代末期菌株中均有检出,表明核糖体蛋白S12和药物转运蛋白MFS是导致植物乳杆菌ATTCC14917对氨基糖苷类抗生素产生高耐药性的重要物质。此外,在链霉素、新霉素和庆大霉素耐药菌株的GL379767染色体120032-120045位置检出的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶(Ser//Thr phosphatase family protein),在链霉素和卡那霉素耐药菌株的GL379764染色体404368-404377位置检出的lrgA蛋白,均导致了植物乳杆菌ATCC14917的耐药性增强。去除抗生素选择压力后,四种抗生素耐药菌株中仅检出了核糖体蛋白S12。此外,GL379768染色体18853-18854位置和GL379766染色体259982位置检出的两个假想蛋白(hypothetical protein)分别在链霉素和庆大霉素去选择压力传代末期菌株中被检出,可能与植物乳杆菌对链霉素和庆大霉素的耐药回复有关。突变位点的转移性检测证实,在高耐药植物乳杆菌ATCC14917基因组区域内没有耐药基因位于可移动元件上,表明植物乳杆菌ATCC14917对氨基糖苷类抗生素的耐药性是安全的。
【学位授予单位】:陕西师范大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2018
【分类号】:TS201.3

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