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《陕西师范大学》 2015年
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与泡沫病毒Bet蛋白互作的宿主蛋白的筛选与鉴定

师妍  
【摘要】:泡沫病毒(Foamy virus)是逆转录病毒科泡沫病毒亚科的唯一成员,能感染多种哺乳动物。其中,猴泡沫病毒(Simian Foamy Virus,SFV)经跨物种传播进化出能感染人的原型泡沫病毒(Prototype Foamy Virus,PFV),PFV目前对人无明显病理损伤且不能实现人传人。与其不致病性形成鲜明对比的是PFV体外感染动物细胞时可引起强烈的致病变效应,使细胞产生空泡而死或维持持续感染(多出现在淋巴细胞)。除了感染特点以外,泡沫病毒的生活周期与基因表达调控与其它逆转录病毒也有很大不同。PFV Bet蛋白是在病毒感染早期就被合成且高水平表达的调控蛋白,但其功能尚不明确。研究发现Bet通过抑制IP活性降低Tas反式激活活性,从而抑制病毒复制;慢性感染时泡沫病毒前病毒以表达Bet蛋白的ΔPFV为主,推测Bet蛋白对PFV慢性感染的建立有重要作用。此外,Bet可与细胞防御因子APOBEC3发生相互作用,阻止后者的包装以保护PFV的复制为了进一步研究泡沫病毒Bet蛋白的调控功能,特别是其与宿主细胞因子的互作,本研究以Bet蛋白为诱饵蛋白,用酵母双杂交系统筛选与之有相互作用的宿主蛋白;对筛选到的SETDB1和ZNF350两个候选蛋白分别进行免疫共沉淀实验验证其与Bet的相互作用;在此基础上,检测宿主蛋白SETDB1和ZNF350对泡沫病毒复制的影响,同时分别构建以其为靶基因的shRNA表达载体,为进一步功能性研究提供基础。本论文主要完成以下研究内容:1、酵母双杂交系统筛选与泡沫病毒Bet蛋白相互作用的宿主蛋白。成功构建了泡沫病毒Bet表达载体pGBKT7-Bet,并将其转化至酵母菌株Y2H,获取蛋白样品后用Myc标签抗体经Western Blot成功检测到Bet蛋白的高水平表达。根据Y2H[pGBKT7-Bet]菌株在缺陷型筛选培养基上的生长情况判定Bet蛋白无自激活活性且对酵母生长无毒,可以作为酵母双杂交的诱饵蛋白。将Y2H[pGBKT7-Bet]菌株与人通用cDNA文库菌株进行杂交,经过两轮缺陷筛选以及单克隆化,最终筛选出44个候选阳性克隆。分别提取阳性克隆质粒并转化至大肠杆菌,测序鉴定出13个候选阳性蛋白。再对其分别进行回转杂交实验,证实13个候选阳性蛋白均可排除假阳性。选取SETDB1和ZNF350进行后续实验。2、SETDB1与Bet体内相互作用初探。将SETDB1表达载体和Bet表达载体共转染至293T细胞,收集细胞裂解液后用Myc标签抗体进行免疫共沉淀。将细胞裂解物和Co-IP产物各自分别用Myc和His标签抗体进行Western Blot检测。结果表明SETDB1确实可以与Bet发生相互作用。将SETDB1表达载体和含PFV基因组全长的pHSRV13质粒共转染至293T细胞,48 h后与LTR-Luc指示细胞系共培养,通过测定荧光素酶活性检测病毒滴度。结果显示SETDB1过表达可抑制泡沫病毒复制。3、ZNF350与Bet体内相互作用初探。将ZNF350表达载体和Bet表达载体共转染至293T细胞,收集细胞裂解液后用Myc标签抗体进行免疫共沉淀。将细胞裂解物和Co-IP产物各自分别用Myc和His标签抗体进行Western Blot检测。结果表明ZNF350确实可以与Bet发生相互作用。将ZNF350表达载体和含PFV基因组全长的pHSRV13质粒共转染至293T细胞,48 h后与LTR-Luc指示细胞系共培养,通过测定荧光素酶活性检测病毒滴度。结果显示ZNF350过表达可抑制泡沫病毒复制。4、SETDB1和ZNF350候选shRNA载体的构建。通过相关在线软件分析及文献查阅,分别设计了三条特异性抑制SETDB1和ZNF350基因表达的siRNA序列。人工合成双链shRNA序列后,将其插入携带有人U6启动子的pLsunny质粒载体中,成功构建了系列siRNA表达载体。本论文首先采用酵母双杂交的方法筛选并鉴定了 13种与PFV Bet相互作用的宿主蛋白,然后对其中的SETDB1和ZNF350蛋白进行了免疫共沉淀验证,证实其与Bet在真核细胞内相互作用的存在。在此基础上分别过表达SETDB1和ZNF350,病毒滴定结果显示两者均对PFV复制有抑制作用。进而构建shRNA表达载体,为进一步的功能性研究提供基础。同时,对实验结果及相关文献的深入分析提示我们Bet可能在PFV复制过程的多个环节中均有重要的功能,需要更深入的研究。
【学位授予单位】:陕西师范大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2015
【分类号】:S852.4

【参考文献】
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