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《陕西师范大学》 2000年
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中国螽(虫斯)总科昆虫的RAPD分析研究

魏朝明  
【摘要】:核酸的分子系统学是从遗传学本质上研究生物之间关系的最精确、最直接 的方法,由于核酸的分子标记具有信息含量大、可供选择的分子类型多、易于确 定同源关系、取样限制少等诸多优于其它分子标记的特点,所以从70年代发展 至今己经成为分子系统学的主要方法,而目前应用的主要有以下几类方法:DNA -DNA杂交法、RFLP(限制性片断长度多态性分析)技术、DNA指纹图谱技术 (DNAfp)、RAPD(随机扩增多态性 DNA)技术、AFLP(扩增的限制性片断长度多 态性)技术以及DNA序列分析技术。其中RAPD技术由于具有高效、快速、简便 等特点,自建立以来,很快就得到了广泛应用。 1. RAPD技术在昆虫学中的研究概述以及螽(虫斯)总科的系统学研究现状 RAPD技术是基于PCR技术的一项DNA分子多态检测技术,利用随机合成 的寡聚核苷酸序列为引物(一般为10bp)分别与 DNA的两条单链结合,在 DNA 聚合酶的作用下,对基因组的特定区域进行PCR扩增,其电泳结果为不同大小 和数目的DNA谱带即RAPD图谱,可反应出基因组相应区域的多态性。RAPD 技术可在对物种没有任何分子生物学研究的情况下,对其DNA进行多态性分析, 并直接运用于分类研究和系统推测,大量的研究已表明RAPD是一种优良的遗 传标记。 材料易保存、需量不大、无需分子生物学研究背景而又操作简便的RAPD 技术一出现就很快被昆虫学家所认可,并且被广泛地应用于种属的分类鉴定、种 下分类、系统发育等多项分子系统学研究中。但是,由于昆虫种类和数量的过于 庞大,目前的研究多集中于一些与人类生产生活关系较为密切的种类如蚊、蝇、 蚜虫等,其它昆虫的研究则相对较少。国内应用RAPD技术于昆虫学研究则更 为滞后。 螽(虫斯)属于昆虫(Insecta)直翅目(Orthoptera)长角亚目(Endifera)螽(虫斯) 总科(Tettigonioidea)。早在 2000多年前,螽(虫斯)就因其能发出动听的鸣声而引起 人类的兴趣。在中国,它们甚至还成为子孙繁盛的象征。这类昆虫与农林牧业关 系密切,有些种类曾造成严重危害,许多种类是重要的天敌昆虫,目前,全世界 己知约900属5000种以上。我国蔬撕总科昆虫超过300种,隶属于10科80余 属。传统的形态分类目前仍是荔撕系统学研究最主要的方法,近代新技术在菌撕 分类上应用的主要有发音和细胞学方法,分子系统学方面的研究很少,国外如 RitChie等口 997)研究报道了荔撕的 RAPD和呜声类型之变异性,国内陕西师范 大学动物研究所 1998年首次将 RAPD技术运用于泰撕总科的分子系统学研究 中,采用2条引物对12种泰撕总科昆虫进行了初步研究。 2.研究目的 本项研究是在前人的基础上,采用多条引物,对6科28属64种蠢撕总科昆 虫进行RAPD扩增,在分子水平上探讨这些种的分类地位和亲缘关系,从而丰 富泰蝴总科的分子系统学研究,并为传统的形态分类提供有力的佐证。 3.材料和方法 3*实验材料 本项研究所用的蠢撕标本,基本上是作者于 1998—2000年赴陕西、四川、 重庆、湖北、甘肃、云南、广西等地采集的,分属于6科28属64种,所有标本 均保存于无水乙醇中。 3.2实验方法 3.2.l基因组 DNA的提取及检测 本实验所采用的基因组 DNA提取方法参考了张迎春(1998)提取瓢虫基因 组 DNA的方法,对实验步骤做了部分修改。该方法的特点为:采用 2 X CTAB 缓冲液;只需CI溶液(氯仿:异戊醇=24:l)抽提一次;用冰冷异丙醇沉淀DNA。 对所提取的DNA样品,本文采用两种方法来检测,即凝胶电泳检测法和紫 外分光光度计检测法。凝胶电泳检测法采用浓度为 1%的琼脂糖凝胶,EB(溪化 乙锭)染色。电泳后置于紫外检测仪上观察结果,如有必要,可用一次成像系统 记录。使用核酸/蛋白质分析仪检测核酸样品的OD值,通过波长260urn的OD 值,计算DNA样品的浓度,通过波长260urn与280urn的OD比值考量DNA样 厂且品纯度,OD260/280值在l.6至l.8间时为较纯的DNA,大于l.8,说明样品中 RNA未除尽;小于1石,说明样品存在有蛋白质。 3.2.2 RAPD扩增 反应体系(总体积20 v帅0下表所示: 扩增反应程序为:预变性:94℃,lmill45s:变性:94℃,305:退火:37OC, lmin30s;延伸:72OC,Zmin;45个循环,循环后,在72C延伸10min。 扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测,具体步骤与基因组DNA凝胶电泳检测类 似,只是琼脂糖凝胶浓度为1.5%,结果记录同DNA样品提取部分。根据记录实 验结果的照片统计原始数据,统计时只记录清晰的条带,将每一引物扩增每一样 品产生的每一条带作为性状看待,当某一扩增带出现时,记作“l”,否则为“0”, 统计实验结果用于聚类分析,聚类分析采用系统聚类法,利用SPSS软件包进行, 建立数据文件后用 Average Linkage Between Groups法构建聚类图。 4.结果分析与讨论 CTAB tZ是一种常用的基因组DNA提取方法,但一般都用来提取植物组织 的基因组DNA,
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