中国螽（虫斯）总科昆虫的RAPD分析研究

【摘要】：核酸的分子系统学是从遗传学本质上研究生物之间关系的最精确、最直接 的方法，由于核酸的分子标记具有信息含量大、可供选择的分子类型多、易于确 定同源关系、取样限制少等诸多优于其它分子标记的特点，所以从70年代发展 至今己经成为分子系统学的主要方法，而目前应用的主要有以下几类方法：DNA -DNA杂交法、RFLP（限制性片断长度多态性分析）技术、DNA指纹图谱技术 （DNAfp）、RAPD（随机扩增多态性 DNA）技术、AFLP（扩增的限制性片断长度多 态性）技术以及DNA序列分析技术。其中RAPD技术由于具有高效、快速、简便 等特点，自建立以来，很快就得到了广泛应用。 1. RAPD技术在昆虫学中的研究概述以及螽（虫斯）总科的系统学研究现状 RAPD技术是基于PCR技术的一项DNA分子多态检测技术，利用随机合成 的寡聚核苷酸序列为引物（一般为10bp）分别与 DNA的两条单链结合，在 DNA 聚合酶的作用下，对基因组的特定区域进行PCR扩增，其电泳结果为不同大小 和数目的DNA谱带即RAPD图谱，可反应出基因组相应区域的多态性。RAPD 技术可在对物种没有任何分子生物学研究的情况下，对其DNA进行多态性分析， 并直接运用于分类研究和系统推测，大量的研究已表明RAPD是一种优良的遗 传标记。 材料易保存、需量不大、无需分子生物学研究背景而又操作简便的RAPD 技术一出现就很快被昆虫学家所认可，并且被广泛地应用于种属的分类鉴定、种 下分类、系统发育等多项分子系统学研究中。但是，由于昆虫种类和数量的过于 庞大，目前的研究多集中于一些与人类生产生活关系较为密切的种类如蚊、蝇、 蚜虫等，其它昆虫的研究则相对较少。国内应用RAPD技术于昆虫学研究则更 为滞后。 螽（虫斯）属于昆虫（Insecta）直翅目（Orthoptera）长角亚目（Endifera）螽（虫斯） 总科（Tettigonioidea）。早在 2000多年前，螽（虫斯）就因其能发出动听的鸣声而引起 人类的兴趣。在中国，它们甚至还成为子孙繁盛的象征。这类昆虫与农林牧业关 系密切，有些种类曾造成严重危害，许多种类是重要的天敌昆虫，目前，全世界 己知约900属5000种以上。我国蔬撕总科昆虫超过300种，隶属于10科80余 属。传统的形态分类目前仍是荔撕系统学研究最主要的方法，近代新技术在菌撕 分类上应用的主要有发音和细胞学方法，分子系统学方面的研究很少，国外如 RitChie等口 997）研究报道了荔撕的 RAPD和呜声类型之变异性，国内陕西师范 大学动物研究所 1998年首次将 RAPD技术运用于泰撕总科的分子系统学研究 中，采用2条引物对12种泰撕总科昆虫进行了初步研究。 2．研究目的 本项研究是在前人的基础上，采用多条引物，对6科28属64种蠢撕总科昆 虫进行RAPD扩增，在分子水平上探讨这些种的分类地位和亲缘关系，从而丰 富泰蝴总科的分子系统学研究，并为传统的形态分类提供有力的佐证。 3．材料和方法 3＊实验材料 本项研究所用的蠢撕标本，基本上是作者于 1998—2000年赴陕西、四川、 重庆、湖北、甘肃、云南、广西等地采集的，分属于6科28属64种，所有标本 均保存于无水乙醇中。 3．2实验方法 3．2．l基因组 DNA的提取及检测 本实验所采用的基因组 DNA提取方法参考了张迎春（1998）提取瓢虫基因 组 DNA的方法，对实验步骤做了部分修改。该方法的特点为：采用 2 X CTAB 缓冲液；只需CI溶液（氯仿：异戊醇＝24：l）抽提一次；用冰冷异丙醇沉淀DNA。 对所提取的DNA样品，本文采用两种方法来检测，即凝胶电泳检测法和紫 外分光光度计检测法。凝胶电泳检测法采用浓度为 1％的琼脂糖凝胶，EB（溪化 乙锭）染色。电泳后置于紫外检测仪上观察结果，如有必要，可用一次成像系统 记录。使用核酸／蛋白质分析仪检测核酸样品的OD值，通过波长260urn的OD 值，计算DNA样品的浓度，通过波长260urn与280urn的OD比值考量DNA样 厂且品纯度，OD260／280值在l．6至l．8间时为较纯的DNA，大于l．8，说明样品中 RNA未除尽；小于1石，说明样品存在有蛋白质。 3．2．2 RAPD扩增 反应体系（总体积20 v帅0下表所示： 扩增反应程序为：预变性：94℃，lmill45s：变性：94℃，305：退火：37OC， lmin30s；延伸：72OC，Zmin；45个循环，循环后，在72C延伸10min。 扩增产物用琼脂糖凝胶电泳检测，具体步骤与基因组DNA凝胶电泳检测类 似，只是琼脂糖凝胶浓度为1．5％，结果记录同DNA样品提取部分。根据记录实 验结果的照片统计原始数据，统计时只记录清晰的条带，将每一引物扩增每一样 品产生的每一条带作为性状看待，当某一扩增带出现时，记作“l”，否则为“0”， 统计实验结果用于聚类分析，聚类分析采用系统聚类法，利用SPSS软件包进行， 建立数据文件后用 Average Linkage Between Groups法构建聚类图。 4．结果分析与讨论 CTAB tZ是一种常用的基因组DNA提取方法，但一般都用来提取植物组织 的基因组DNA，

【关键词】：RAPD 螽（虫斯）总科 直翅目 中国
【学位授予单位】：陕西师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2000
【分类号】：Q969
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