中国蟋蟀总科昆虫RAPD分析研究

【摘要】： RAPD(随机扩增多态性DNA)技术是二十世纪90年代发展起来的一项DNA分子多态性检测技术，它建立于聚合酶链式反应(PCR)技术基础之上，利用随机合成的寡聚核苷酸序列为引物(一般为10个bp)，分别与DNA的两条单链结合，在DNA聚合酶的作用下，对基因组的特定区域进行PCR扩增，其电泳结果为不同大小和数目的DNA谱带即RAPD图谱，可反映基因组相应区域的DNA多态性。RAPD技术可在对物种没有任何分子生物学研究的情况下对其进行DNA多态性分析，有助于系统学研究中广泛进行物种间比较。大量的研究表明RAPD具有个体、群体、亚种、种等各水平的特异性，并且是按孟德尔方式遗传的，因而是一种优良的遗传标记。由于该技术高效、快速，对材料的要求不高，取材少、成本低，又无需分子生物学背景且操作简便，所以一出现就被昆虫学家所认可，并广泛的应用于分类学及系统发育研究。但是，目前的研究主要集中于一些与人类生活关系较为密切的种类(如蚊、蝇、蚜虫等)，其它昆虫的研究相对较少。国内应用RAPD技术于昆虫系统学研究则更滞后。 蟋蟀隶属于昆虫纲(Insecta)直翅目(0rthoptera)长角亚目(Endifera)蟋蟀总科(Gfylloidea)，是人类常见的昆虫类群之一。早在一千多年前，蟋蟀就因能发出动听的鸣声而引起人类的注意。目前，全世界已知约490多个属、3500多种，我国蟋蟀总科昆虫已知约64属、200多种。这类昆虫中，许多种类是著名的娱乐观赏昆虫，有些种类对农林业造成严重危害，与人类有着密切的关系。然而对蟋蟀的系统学研究还很不完善，传统的形态分类目前仍是其系统学研究的主要方法，而蟋蟀类昆虫近缘种现象较为普遍，在许多方面，学者的观点不一，争议也较大。近代新技术在蟋蟀系统学研究上应用的主要有发音和细胞学方法，分子系统学方面的研究较少。蟋蟀总科的分子系统学的研究也主要集中在个别种种内或种间mtDNA多态性方面及个别种同工酶的研究上，而利用RAPD技术进行蟋蟀基因组DNA多态性方面的研究在国内外更少，国外仅见Chu，J．等(1995)利用RAPD标记区分美国东部一杂交地带的蟋蟀的两个姐妹种，Allonemobius Fasciatus和A.socius，并于1998年使用RAPD和异型酶标 iC做出了这两种蟋蟀的基因连锁图；国内田英芳、郑哲民（2 0 of）首次将RAPD 技术运用于蟋蟀总科的分子系统学研究中，采用2种引物对7种蟋蟀进行了基 困组DNA多态性研究，并应用UPG问A法构建树状图，椎测系统发生关系．本项 研究在依据外部形态分类鉴定及前人工作的基础上，采用RAPD技术，通过对蟋 蟀总科7科26属57种蟋蟀基因组DNA的RAPD图谱的比较研究，在分子水平上 探讨这些类群的分类地位和亲缘关系，为丰富蟋蟀总科的分子系统学研究，并 为进一步完善蟋蟀总科的分类系统，揭示其系统发育及演化提供分子水平的依 据。本研究经用 5 4种随机引物对 5 7种蟋蟀的 RAPD扩增分析得出以下结论： 1）采用 RAPD技术，首次较系统地对中国蟋蟀总科 7科 2 6属共 5 7种蟋蟀 进行了系统学研究。在所试用的54种随机引物中筛选出可扩增出清晰可辨且稳 定的 RAPD图谱的引物分别为：蟋蟀科 9种、岭蟋科 9种、树蟋科 12种、结蟋 科12种、蛛蟋科13种、铁蟋科13种、貌蟋科13种。这其中有7种引物：SS、 583、5142、550、555、561、5379可通用于蟋蟀总科 7科不同种类的 RAPD扩增， 其中 S 8、SI4 2、S 8 3、S 5 5这 4种引物可用来鉴别蟋蟀的性别。 2）在提取蟋蟀总科昆虫的基因组DNA时，比较了CTAB法和蛋白酶K法两 种方法，结果显示蛋白酶【法更适用于蟋蟀总科昆虫的基因组则A的提取。 3）蟋蟀同种不同个体、不同性别的RAPD扩增聚类分析结果显示，同种的 不同性别先各自相聚，然后同一种的再聚在一起，这说明，同种不同性别和不 同个体之间存在不同程度的差异，但性别差异及个体差异均小于种间差异。 4）蟋蟀同种不同个体、不同性别的聚类分析结果显示，同种的不同性别各 自相聚且明确区分，说明所选用的弓】物与基因组DNA结合位点的染色体恰好位 于性染色体上，困而能把同种的不同性别清楚地区分开．由此，可以得出：只 要选用适当的引物，RAPD技术可被用来鉴别物种的性别。 5）RAPD是研究蟋蟀总科昆虫系统学的一种优良的分子标i己，在研究个体 间、属内种间乃至近缘属间的亲缘关系时都具有广泛的适用性，但对亲缘关系 较远的属其应用受到很大的限制；同时，RAPD技术能很好的解决蟋蟀总科许多 种类雌性难以区分的问题。 6）蟋蟀科油葫芦属、斗蟋属、棺头蟋属三个属的属内聚类分析结果所呈现 的属内种间关系与传统方法所得的结果基本一致，且结果支持黄脸油葫芦、黑 卜 脸油葫芦为独主种的观点。另外，整个蟋蟀科12属的聚类分析结果显示，这i