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超声激活血卟啉抗肿瘤的细胞学研究

刘全宏  
【摘要】: 通过对小鼠腹水型S180、在体S180肉瘤细胞、艾氏腹水瘤细胞和离体培养的人结肠癌细胞(SW-480)、黑色素瘤细胞(LiBr)等的研究,筛选出不同细胞对超声激活血卟啉杀伤的敏感阈值,并从处理后不同肿瘤细胞在显微结构、超微结构、细胞化学、分子结构等方面的变化对超声激活血卟啉抗肿瘤的细胞分子生物学机理进行了初步的分析。研究中发现在一定实验条件下确实存在国外学者提出的单线态氧等自由基对肿瘤细胞的杀伤作用,但不是SDT(Sonodynamic therapy)抑癌作用的唯一机制。SDT抗肿瘤机制存在多种模式,且受不同理化因子和复杂的生物学因素交互影响。尤其是实验中首次发现的低强度超声激活血卟啉能诱导四种肿瘤细胞凋亡的现象,表明在SDT抗肿瘤机制中存在着促细胞死亡和诱导细胞凋亡两种模式。这一研究成果对于丰富和发展SDT理论,深入SDT抗癌机制研究具有一定的科学意义。本论文所阐述的结论主要有下述方面: 1.SDT抗在体S180腹水型癌细胞和实体瘤细胞研究 ①通过超声激活血卟啉对S180肉瘤生长状况的研究筛选出了作用于S180实体瘤有效的最低超声强度及处理时间。本实验发现血卟啉对肿瘤的抑制作用甚微,对肿瘤体积的抑制率为3.19%,对重量的抑制率为0.39%;当超声强度为0.6W/cm~2,超声对肿瘤体积及重量的生长抑制率分别为57.07%和39.9%,而同样的超声强度结合血卟啉对肿瘤体积及重量的生长抑制率分别增加至87.15%和78.8%。荷瘤小鼠实验表明:血卟啉对肿瘤组织生长的抑制作用甚微,单纯超声有一定的抑制肿瘤生长效应,而超声激活血卟啉能够有效的抑制肿瘤组织的生长。 ②利用光镜及透射电镜技术观察处理后肉瘤组织细胞形态结构的变化。研究结果表明,血卟啉对肿瘤细胞影响较小,单纯超声和超声激活血卟啉均具有破坏细胞结构的作用,其破坏作用表现在生物膜系统和遗传信息表达系统受损,线粒体是SDT杀伤肿瘤细胞的敏感细胞器。 ③利用酶组织化学技术检测超声激活血卟啉对细胞色素C氧化酶活性的影响。发现血卟啉对肿瘤组织细胞色素C氧化酶的活性影响较小,超声对酶活性有一定程度的影响,而超声激活血卟啉使细胞色素C氧化酶的活性大幅度降低。酶活性的降低在处理后1h就已表现出来,在处理后3h、6h酶活性持续降低,这一动态变化表明细胞能量合成功能持续下降是细胞继发性损伤的重要原因之一。 ④首次利用扫描电镜技术观察同一频率,不同强度的超声处理后腹水型 SI 80 肿瘤细胞表面结构的变化。结果表明血叶咐对细胞有一定的影响,主要表现为微 绒毛的减少:不同超声强度对细胞形态和表面结构亦有轻度的损伤,但在同等强 度和处理时间条件下,超声激活血叶琳对肿瘤细胞的损伤最大,大部分细胞破损 为碎片或带有泡状突起的细胞残片。 ⑤首次在 SDT抗在体 SI 80腹水型癌细胞和肉瘤细胞研究中,发现超声激活 血叶琳诱导肿瘤细胞凋亡现象。 SDT抗在体S 180腹水型癌细胞和肉瘤细胞研究相对于离体培养细胞的简单实 验系统,是一个受体内多因素影响的复杂实验系统。由于肉瘤组织的异质性,细 胞间相互影响、细胞内血叶琳富集和代谢、细胞所处的微环境等特殊性,所以导 致肉瘤组织细胞受超声激活血叶琳处理后的细胞形态学变化和细胞凋亡特征与离 体培养的游离细胞有一定的差异。而且在杀伤细胞的超声强度、频率、辐照时间 等参数阈值方面也有所不同。 首次从受损细胞的生物膜结构、细胞骨架系统和遗传信息表达系统变化探讨 SDT抗肿瘤的细胞分子生物学机制,阐明显微、超微结构和分子结构变化对细胞生 理功能的影响,研究中发现线粒体超微结构及其内膜标记酶活性状态是SDT抗癌 作用的敏感位点,是导致肿瘤细胞原发性损伤、继发性损伤直至死亡的直接原因 和间接原因。细胞是一个高度有序的结构体系和自控系统,线粒体作为细胞生命 活动能源的主要提供者,其结构与功能的破坏必然形成细胞代谢“能障”,使细胞 内生物合成受阻、信号传导和生理调节失控,细胞结构稳定性破坏,最终导致细 胞死亡。 2.SDT抗艾氏腹水瘤细胞研究 ①首次采用不同超声强度对体内生长的艾氏腹水瘤细胞进行体外处理,筛选 出mT抗艾氏腹水瘤体外实验条件。发现在频率2.OMHz,强度1.OW/cm’。1.SW/cm’。 2.Ow/cm’时超声激活血叶晰对艾氏腹水瘤的杀伤作用规律。 ②阐明了不同强度下,艾氏腹水瘤生物膜系统、遗传信息表达系统显微结构 和超微结构受损的特征及程度,分析了细胞受损的敏感部位,并对SDT的抗癌作 用进行了初步的细胞学研究。 ③通过形态学研究和荧光双染检测,首次发现超声激活血叶琳可诱导艾氏腹 水瘤细胞凋亡现象,讨论了不同强度处理下细胞凋亡和直接损伤造成的细胞坏死 的相对数量及转化。提出SDT诱导细胞凋亡是抗肿瘤?


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