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拟黑多刺蚁和意大利蜜蜂雌激素相关受体基因的克隆与表达研究

欧阳霞辉  
【摘要】: 核受体组成一个蛋白质大家族,它们作为配体调节的转录因子,能够直接与DNA结合,调节下游靶基因的表达。在这个大家族里面,有一些受体分子没有已知的配体,称它们为孤儿核受体。雌激素相关受体(ERRa,ERRβ,and ERRγ)属于孤儿核受体,在结构上和ER非常类似,它们和ER共同构成核受体超家族的第三亚族,它们能够直接与类固醇激素受体共激活子结合激活靶基因的表达。研究表明,哺乳动物ERRs参与ER信号通路,与众多生理和发育过程有关,参与细胞的增殖与分化。拟黑多刺蚁和意大利蜜蜂属于社会性昆虫,它们与人类关系密切,是重要的资源昆虫,对于它们生殖与发育的相关研究具有重要的现实意义。本研究以拟黑多刺蚁和意大利蜜蜂为研究材料,采用RT-PCR、5’与3’Race、荧光实时定量PCR和原位杂交等实验方法对这两种昆虫雌激素相关受体基因进行了克隆和表达研究,以期为进一步的探讨昆虫中雌激素相关受体的功能奠定基础。研究结果如下: 1.拟黑多刺蚁雌激素相关受体基因pvERR全长1935bp,包含一个1305bp的开放阅读框、245bp的5’-UTR和385bp的3’-UTR,编码一个由434个氨基酸组成的蛋白质,分子量49.0989KD,理论等电点为6.62。pvERR基因有八个外显子和七个内含子。将pvERR基因核苷酸序列上传Genbank,序列号为:EF474463。 2.意大利蜜蜂雌激素相关受体基因amERR全长1779bp,包含一个1305bp的开放阅读框、197bp的5’-UTR和277bp的3’-UTR,编码一个由434个氨基酸组成的蛋白质,分子量49.131KD,理论等电点为7.43。amERR基因有八个外显子和七个内含子。将amERR基因核苷酸序列上传Genbank,序列号为:EF506198。 3.同源性分析表明,pvERR和amERR的氨基酸序列相似性为89.9%;它们的氨基酸序列与三种双翅目昆虫(埃及伊蚊aaERR、斯氏按蚊asERR和黑腹果蝇dERR)ERRs的相似性都在50.2%~53%之间;它们与人类三种ERRs的相似性在37.6%~44%之间。基于NJ法构建的进化树显示,pvERR和amERR形成一支,与所有已知的昆虫ERRs聚在一起;它们与人类ERRs的关系比双翅目昆虫与人类的更近,也就是说,单从ERRs来看,在进化关系上,pvERR和amERR比aaERR、asERR和dERR都要进化。 4.采用APSSP2法对pvERR和amERR蛋白的二级结构预测结果表明,在pvERR和amERR蛋白的DNA结合区(DBD,105~177),有四个B折叠和三个a螺旋,主要由序列中位于110、113、117、120位的半胱氨酸(Cys,C)形成第一个锌指结构;由位于136、142、152、155位的半胱氨酸(Cys,C)形成第二个锌指结构。pvERR和amERR蛋白的配体结合区(LBD,206~429),主要由两个B折叠和11个a螺旋(H1~H12)构成,而多数ERR的LBD是一个由12个a螺旋(H1~H12)形成的三明治式的结构,通过比对,发现pvERR和amERR蛋白都缺少H2,这与哺乳类已知晶体结构的ERRγ的配体结合区结构非常类似。 5.采用SwissModel First Approach对pvERR和amERR蛋白的三级结构预测结果表明,pvERR和amERR蛋白的DBD结构与人类ERRB的DBD结构非常相似;amERR与pvERR的LBD的空间结构差别是amERR的最后一个a螺旋是向模型内部伸入的,而pvERR的则是向外伸出的,这与它们的亲水性有关。配体结合区的AF-2恰好是在最后一个a螺旋区(H11),AF-2的结构和功能因结合的配体类型不同而不同,所以这说明amERR与pvERR的配体存在一定的差异。 6.采用2~(-△△CT)法,对拟黑多刺蚁不同发育阶段和不同品级中pvERR mRNA和意大利蜜蜂不同发育阶段和不同品级中amERR mRNA的表达量进行相对定量分析,结果显示,随着昆虫发育,pvERR和amERR基因的mRNA表达量逐渐增加,成虫中的表达量高于幼虫期;在不同品级中,蚁后pvERR mRNA的表达量高于工蚁和雄蚁,雄蚁中的最低;蜂王amERR mRNA的表达量高于工蜂和雄蜂,雄蜂中的最低。结果表明,社会性昆虫雌激素相关受体基因mRNA的表达模式非常相似,ERR可能与社会性昆虫的发育有关;pvERR和amERR基因的mRNA在蛹期到成虫期相对表达量有了显著增加,可能说明它们在成虫的组织分化中具有重要作用;成虫阶段pvERR和amERR基因的mRNA表达量均高于幼虫期,说明昆虫组织中ERR可能与哺乳动物的ERRs一样分布比较广泛,而不同品级间的表达差异可能与它们在社会性群体中的职能有关。 7.对拟黑多刺蚁不同品级脑中pvERR mRNA的表达进行原位杂交检测,结果显示,pvERR mRNA在不同品级的蕈形体、附叶、视叶、中脑、食道下神经节和球状细胞中有表达。在蚁后脑中,蕈形体和球状细胞中pvERR mRNA的阳性表达最为明显,食道下神经节、附叶和视叶中的次之,而中脑和中央体中的表达最弱。pvERR mRNA的表达模式可能与蚁后在蚁群中的职能和地位是相关的,说明pvERR可能与视觉方面的学习记忆以及求偶调节等有关。在工蚁脑中,蕈形体、视叶、附叶和球状细胞中的阳性反应强度跟蚁后相似,但是在中脑的阳性反应强度明显高于蚁后和雄蚁。工蚁在蚁群中的行为最为复杂,pvERR mRNA在工蚁蕈形体及中脑的表达模式,可能说明pvERR与工蚁的嗅觉辨别以及学习与记忆功能有关。与蚁后和工蚁相比,pvERR mRNA在雄蚁蕈形体、附叶以及食道下神经节的表达强度弱于蚁后和工蚁,但视叶中有较强的表达。雄蚁的职责是与蚁后交配,而视觉信息在求偶过程中具有重要作用,所以推测pvERR mRNA在视叶和蕈形体的表达与视觉信息的整合有关,进而对求偶行为起调控作用。 8.采用地高辛标记的特异性寡核苷酸探针对拟黑多刺蚁性腺中pvERR mRNA的表达进行了原位杂交检测,结果显示,pvERR mRNA在卵子发生过程中滤泡细胞的胞质和生长期、卵黄发生期的卵母细胞有表达;在变形期的精细胞胞质和成熟精子头部有很强的表达。在卵子发生早期阶段,滤泡细胞中pvERR mRNA的阳性表达可能与它们自身的增殖和分化有关。卵母细胞生长阶段,滤泡细胞和卵母细胞中pvERR mRNA的表达模式可能说明滤泡细胞给卵母细胞提供了发育信息,而卵黄生成期卵母细胞中pvERR mRNA的表达可能说明pvERR与卵黄物质的形成有关。变形期的精细胞胞质和成熟精子头部有很强pvERR mRNA的表达,说明pvERR可能参与了精细胞的发育调控和精子的成熟。 本项研究首次发现在社会性昆虫中存在雌激素相关受体基因(拟黑多刺蚁pvERR和意大利蜜蜂amERR基因),将它们的序列克隆并上传GeneBank;首次发现pvERR和amERR基因在系统发育关系上比果蝇dERR更进化;采用相对实时定量法首次发现社会性昆虫中ERR基因与昆虫发育有关;采用原位杂交法首次发现ERR在昆虫脑和性腺中表达。这些结果将有助于深入探讨昆虫中雌激素相关受体的具体功能,对于搞清昆虫中类固醇激素受体在昆虫发育以及其它生理方面的关系奠定理论基础。


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