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拟黑多刺蚁extradenticle基因的克隆及其在mRNA水平上的表达研究

卢晓  
【摘要】: extradenticle(exd)基因最初是作为Hox基因的辅因子在果蝇突变体中被发现的,它编码的蛋白属于PBC蛋白家族成员。但是随着研究的深入,越来越多的证据表明extradenticle有着更为广泛的生理作用,比如,它在节肢动物的附肢发育及昆虫的背板形成中起重要作用。 拟黑多刺蚁(Polyrhachis vicina Roger)隶属于膜翅目(Hymenoptera),蚁科(Formicidae),多刺蚁属(Polyrhachis),是一种社会性昆虫和资源昆虫,其群体具有多态现象,品级分化为工蚁、雌蚁和雄蚁,行为复杂、分工明确。本研究以拟黑多刺蚁为实验材料,采用RT-PCR,5’与3’RACE技术,克隆了extradenticle基因的全长cDNA序列;又利用生物信息学方法对其进行了序列分析、进化关系分析和功能预测;应用实时定量PCR技术对extradenticle在拟黑多刺蚁体内的mRNA水平表达进行了相对定量。所获实验结果为: 1.拟黑多刺蚁extradenticle基因cDNA序列全长为1854bp,其中包含一个542 bp的5’端非编码区(5’-UTR)、一个136 bp的3’端非编码区(3'-UTR)和一个开放阅读框(ORF),其终止密码位于1716-1718位核苷酸。其开放阅读框编码319个氨基酸残基,生物信息学软件分析其编码蛋白的理论等电点为6.53,分子量为42.7kDa,。将拟黑多刺蚁extradenticle的全长cDNA序列命名为Pvexd,并上传至GenBank数据库,所得序列号为GU223153。 2.序列比对,同源性分析表明PvEXD蛋白与其他动物的extradenticle同源基因编码的蛋白的相似性介于58.5%和98.2%之间,其中与意大利蜜蜂EXD的氨基酸序列相似度最大,为98.2%。基于NJ法构建的进化树显示,PvEXD与蜜蜂的EXD先形成一支,然后与其他己知的昆虫EXD聚在一起,最后与脊椎动物PBX聚为一树。生物信息学分析还表明,PvEXD蛋白不是分泌型蛋白。PvEXD蛋白包括一系列的功能位点:3个N型糖基化位点、2个cAMP磷酸化位点、4个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、7个肉豆范酞基化位点、2个蛋白激酶C磷酸化位点、1个酪氨酸激酶磷酸化位点。PvEXD蛋白的二级结构为mixed型。 3.采用荧光实时定量RT-PCR定量技术对extradentic在拟黑多刺蚁的不同发育阶段的整个虫体、不同品级的成虫虫体和不同品级的成虫头部的mRNA表达水平进行的相对定量分析的结果显示:从拟黑多刺蚁的发育过程来看,Pvexd在卵期的表达量较高。从卵到三龄总体上呈下降趋势,但一龄到三龄的三个龄期表达差异在统计学上不显著,到四龄Pvexd表达量有所回升,在蛹期的表达量最低。到成虫后又有一明显增多。据Pvexd在拟黑多刺蚁的幼虫虫体和成虫虫体内mRNA水平的表达差异性推测,PvEXD蛋白通过调节细胞分化、细胞凋亡和组织分化,进而参与了个体发育的过程,或是在调节成虫比较复杂的行为中起到重要的作用。对于成虫的三个品级,无论在全身或是在头部,Pvexd在工蚁中的表达量都比雌蚁和雄蚁多,这可能与工蚁独特的品级分化有关,或与工蚁神经系统的形成有关。extradentic在雌蚁和雄蚁全身中的表达量差异不显著,而在二者头部的表达差异显著,雄蚁中的表达量大约为雌蚁中的8倍。由此推测Pvexd可能在蚂蚁精子发生或卵子发生,亦或是在与性别分化有关的生理过程的调控中起作用。 本研究首次从社会性昆虫——拟黑多刺蚁体内克隆出extradentic基因的全长cDNA序列,并将其序列上传至GenBank数据库;利用分子生物信息学的方法,分析了extradentic基因的进化关系;通过荧光实时定量PCR进行的相对定量发现Pvexd mRNA在拟黑多刺蚁的不同发育阶段虫体、不同品级的成虫虫体和不同品级的成虫头部中的表达具有差异性。这些结果将会为进一步探讨extradentic基因的功能及对昆虫发育产生的作用和影响奠定基础。


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