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大鲵皮肤粘液糖蛋白的提取纯化及抗肺癌活性研究

徐伟良  
【摘要】:大鲵(Andrias davidianus Blanchard)属大型两栖纲、有尾目、隐鳃鲵科,是国家二级保护动物,有活化石之称。大鲵皮肤腺体主要有粘液腺和颗粒腺两种,粘液腺细胞可释放粘糖蛋白,与水结合后成为黏液,覆盖在上皮游离面,形成了一道天然的防护屏障。大鲵皮肤颗粒腺体能够分泌一种具有特殊性气味的白色粘液,其成分是含有抗菌肽、糖蛋白等功能复杂多样的药理活性物质,对广普抗菌、抗氧化、抗疲劳、抗肿瘤等起着非常明显的作用。本文以大鲵皮肤粘液为研究对象,通过碱提取及层析色谱的方法对粘液糖蛋白进行制备,并利用MTT比色法进行体外抗肺癌活性检测。主要研究结果如下:(1)大鲵皮肤粘液组份分析。通过对大鲵皮肤粘液中糖、脂肪、蛋白质主要成分分析表明,大鲵粘液中总糖含量为3.69%;粗脂肪含量为4.25%,其中含11种脂肪酸,不饱和脂肪酸中以油酸、亚油酸和亚麻酸含量的较高,分别为27.73%、9.80%、9.20%。饱和脂肪酸中以棕榈酸、肉豆蔻酸、硬脂酸含量较高,分别为21.53%、5.92%、3.61%。总蛋白质含量为86.56%;总氨基酸含量达83.97%,其中含17种氨基酸成分,以谷氨酸、脯氨酸、甘氨酸及赖氨酸的含量较高,分别为8.31%、7.99%、6.90%、6.53%。除色氨酸因水解未检到,其余7种人体必需氨基酸含量占总氨基酸的33.96%。通过对大鲵粘液中挥发性气体成分分析,共检测出10种挥发性物质,包括二甲基二硫醚(C2H6S2)和8种脂类化合物,二甲基二硫醚为特殊性气味的主要成因。(2)大鲵粘液糖蛋白的提取分离及纯化。以糖蛋白抗肺癌生物活性为前提,确定了粘液糖蛋白碱提取方法是:以0.4mol/L的Na OH溶液,料液比为1:25,在45℃下,提取2h;提取液以4000r/min,离心15min,上清液中加入无水乙醇至终浓度为76%,调p H至7.0左右,于4℃冰箱中静置醇沉8h;离心去除上清液,糖蛋白沉淀用无水乙醇洗涤三次后,真空干燥得大鲵粘液糖蛋白粗品。对粘液糖蛋白粗品用DEAE-52阴离子交换层析纯化,收集出峰样,透析、浓缩后用Sephadex G-100凝胶柱色谱再次纯化,最终得到一种相对较纯的糖蛋白组分。通过SDS-PAGE蛋白电泳检测,该糖蛋白为单一组分,其分子量约为30k Da。(3)大鲵粘液糖蛋白组份分析。通过高效液相色谱和氨基酸自动分析仪对大鲵粘液糖蛋白的单糖组分和氨基酸组分进行分析。结果表明粘液糖蛋白中含有6种单糖组分,其摩尔比为甘露糖(Man):葡萄糖醛(Glc UA):半乳糖醛酸(Gal UA):N-乙酰氨基葡萄糖(Glc N):葡萄糖(Glc):半乳糖(Gal)=1.71:4.12:1.09:1.55:1.00:2.09。氨基酸总含量为61.86%,共检测出17种氨基酸,其中谷氨酸、脯氨酸、天冬氨酸和甘氨酸等含量较高,分别为7.20%、6.39%、5.62%、5.43%。(4)大鲵粘液糖蛋白体外抗肺癌活性研究。通过体外MTT实验检测大鲵粘液糖蛋白对人肺腺癌细胞A549的生长抑制作用。当糖蛋白浓度为40ug/m L,作用48h时,碱提取糖蛋白、DEAE-52层析糖蛋白和Sephadex G-100层析糖蛋白对A549细胞的抑制率达到最高,分别为88.43%、91.34%、92.32%。随糖蛋白样品浓度从1、10、20、40ug/m L的增加,不同来源的粘液糖蛋白对A549细胞的抑制作用由高到低分别为Sephadex G-100层析糖蛋白DEAE-52层析糖蛋白碱提取糖蛋白。随着培养时间的延长,大鲵粘液糖蛋白对A549细胞的抑制作用明显增大,其抑制率在一定浓度范围内有时间依赖性。与阳性对照紫杉醇相比较,对A549细胞增殖抑制作用差异极显著(p0.01)。利用倒置光学显微镜观察大鲵粘液糖蛋白对A549细胞作用48h前后形态变化的影响。结果表明,在光镜下两种细胞均出现数量明显减少,细胞出现变小、褶皱、变圆,与周围细胞连接减少,部分细胞从底壁上脱落等明显形态变化。


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