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《陕西理工大学》 2020年
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鸡CYP27A1对维生素D_3的羟化功能研究

陈思航  
【摘要】:CYP27A1是主要存在于肝脏中的一种细胞色素P450酶,是一种功能多样且非常重要的CYP450酶。在人类体内,CYP27A1在维生素D_3的C-25位羟化过程以及胆汁酸合成中具有重要作用,是人类生命代谢中非常重要的酶。到目前为止,人们对人类维生素D羟化酶的研究已经比较成熟,但是对禽类的维生素D羟化酶研究还非常有限,维生素D在鸡的产蛋量、蛋壳硬度、骨骼强度以及孵化率等方面具有重要影响。因此研究鸡体内的维生素D羟化酶具有重要意义。经研究分析后发现,鸡体内的CYP27A1与人的CYP27A1同源性较高,且鸡的CYP27A1也是鸡体内源及外源化合物代谢的关键羟化酶,由此推测鸡体内的CYP27A1可能参与维生素D_3的代谢。本实验选择以鸡的CYP27A1为研究对象,探究鸡体内的CYP27A1是否对维生素D_3具有羟化作用。在本研究中,首先采用了生物信息学软件对鸡的Cyp27a1编码的氨基酸序列进行了分析,对之后鸡Cyp27a1的异源表达研究以及理化性质研究提供参考。其次以鸡Cyp27a1的cDNA序列为模板克隆了鸡Cyp27a1基因的ORF序列,之后将鸡Cyp27a1的ORF片段连接到pcDNA~(TM)3.1/myc-His(-)A载体,构建出pcDNA-Cyp27a1真核表达载体,并且在293T细胞中成功表达。最后对重组的鸡Cyp27a1基因异源表达的蛋白进行了酶活分析,构建体外膜组分的重组体系,将鸡重组pcDNA-Cyp27a1表达的蛋白与维生素D_3在体外进行孵育。初步探讨了鸡的CYP27A1对维生素D_3的羟化作用,该研究结果可为鸡的CYP27A1后续研究提供资料。主要研究结果如下:1.通过序列比对,发现鸡CYP27A1基因与人的CYP27A1序列相似度较高约为57%,之后采用多种生物信息学软件对鸡Cyp27a1基因所编码的氨基酸序列进行分析。分析结果显示,鸡CYP27A1蛋白与人CYP27A1、CYP27B1等具有相似的功能,是定位于线粒体内膜的一种蛋白,二级和三级结构预测显示,其具有P450酶系的典型结构。2.将鸡Cyp27a1的ORF片段连接到pcDNA~(TM)3.1/myc-His(-)A载体上,构建真核表达载体,送测序后检测结果与预测条带大小相符。将pcDNA-Cyp27a1载体瞬时转染293T细胞,经Western Blotting检测结果显示,表达的蛋白条带大小为58.827 kD,与预测的蛋白大小一致,由此证明,鸡Cyp27a1在293T细胞中成功表达。3.酶活检测结果显示,pcDNA~(TM)3.1/myc-His(-)A对照组未检测到25(OH)D_3,而pcDNA-Cyp27a1实验组检测到产物25(OH)D_3。结论:以上研究结果表明鸡的CYP27A1与人CYP27A1蛋白具有相似的功能,它是鸡体内的一种维生素D 25-羟化酶,能够将维生素D_3羟化为25(OH)D_3。
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