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《陕西理工大学》 2020年
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VDR敲除小鼠睾丸组织转录组学分析及脂代谢相关基因筛选研究

左甜甜  
【摘要】:VDR(Vitamin D Receptor,VDR)是转录因子核受体家族的成员,主要通过调控靶基因的表达,参与调节钙与磷酸盐代谢、骨骼发育、脂代谢、细胞增殖分化、神经系统发育、免疫调节,抗肿瘤发生和生殖调控等多种生物学功能。实验室前期构建了VDR敲除鼠,发现VDR敲除后小鼠生殖能力显著下降,脂肪合成减少。基于此,本研究采用Illumina Hiseq测序平台,对6月龄和12月龄的VDR敲除型和野生型小鼠睾丸组织进行了转录组学分析,以期在睾丸组织中筛选出受VDR调控的与脂代谢相关的相关基因。在获得脂代谢基因SCD-1(stearoyl-coA desaturase1,SCD-1)后,利用RT-q PCR技术对SCD-1基因进行组织表达谱分析,然后采用细胞免疫化学染色方法分析SCD-1在睾丸组织不同类型细胞中的表达水平和细胞定位,最后基于VDR和筛选的脂代谢基因SCD-1的超表达和干扰实验,通过RT-qPCR和Western blot技术在小鼠睾丸间质细胞探究了VDR和SCD-1的互调关系。本研究获得了小鼠睾丸组织中VDR调控的脂代谢基因,并初步分析了VDR与SCD-1之间的相互影响关系,研究结果为VDR调控脂代谢和通过脂代谢介导的雄性生殖方面的研究提供基础数据。本研究所得结果如下:1.转录组测序数据质量Q30值在89%以上,组装的碱基数为3.5×109 bp,在Gene ID、UniProtKB、GO,KEGG和eggNOG数据库中的覆盖率分别为93.93%、92.25%、94.12%,60.76%和74.58%,比对到外显子区域的Reads总数在92%以上。2.VDR敲除显著影响了小鼠睾丸组织的基因表达,6月龄和12月龄WT和VDR-/-小鼠中共有的差异表达基因有23个。3.GO和KEGG富集分析发现,VDR敲除导致的差异表达基因参与多种生物学过程,其中涉及差异基因最多是代谢、有机体系统和人类疾病等方面。在差异表达基因富集的前20个代谢通路中,6月龄组富集最显著的是脂代谢相关的PPAR信号通路(PPAR signaling pathway),12月龄组富集最显著的是类固醇激素合成(Steroid hormone biosynthesis)。4.分析发现6月龄和12月龄小鼠睾丸组织中涉及脂代谢的共同存在的差异基因是参与PPAR信号通路的SCD-1基因,在VDR基因敲除后,SCD-1表达水平显著下降。5.小鼠SCD-1基因组织表达谱分析发现,该基因在多种组织中表达,脂肪组织表达最高,其余依次为肝脏、肌肉、肺、皮肤、睾丸,肾脏、心脏、胸腺、脾脏和小肠。VDR敲除后,心脏、皮肤、脂肪、肌肉、小肠、胸腺组织的SCD-1表达显著上调,肝脏和睾丸中SCD-1的表达量显著下降。6.通过对睾丸组织间质细胞TM3、精原细胞GC-1和精原干细胞C18-4)中SCD-1的表达情况分析发现,间质细胞TM3表达量最高,精原干细胞C18-4表达量较低,同时发现SCD-1主要分布在细胞质中。在TM3细胞中通过研究VDR与SCD-1的互调关系,发现VDR保证了TM3细胞中SCD-1基因的正常表达,且存在SCD-1负反馈调控VDR现象,SCD-1表达过高会抑制VDR的表达。
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