泽漆的体外抗肿瘤作用及其生物活性组分研究

【摘要】：研究背景：癌症是成年人死亡原因的主要疾病。以外科手术为主的综合治疗是当前的主要治疗方法,但术后肿瘤的复发、转移是临床最为棘手的问题之一,特别是晚期肿瘤还缺少特别有效的治疗办法。因此,寻求效果确切、成本低廉、毒性反应轻的药物,为当前需要迫切解决的问题。泽漆,大戟科植物,广泛野生于全国大部分地区。据古籍记载,泽漆很早就用于预防和治疗多种疾病,如肝癌、食管癌、鼻咽癌、支气管炎、急性肾炎及流行性腮腺炎等,并有复方泽漆散等成药付诸应用。现代研究表明,泽漆根的水提取液在体外、体内均有抗肿瘤作用。泽漆中分离得到的单体物质,如槲皮素及其苷、羽扇豆醇、没食子酸及金丝桃苷等经体外实验证明具有抗肿瘤作用,具有很大的开发利用价值。但是,目前有关泽漆的抗肿瘤作用的深入研究还不多,其抗癌活性部位在哪里?何种成分对其抗癌活性起着主导性作用,微量元素在其中发挥何种作用,重金属元素是否是其毒性成分之一?对此目前尚未见报道。 目的：进一步明确泽漆的体外抗肿瘤活性,筛选其抗癌活性部位,并对其抗癌机制进行初步探讨；对其主要活性成分含量进行测定和分析；调查泽漆中微量元素及重金属元素的含量及分布状态,为泽漆的开发利用提供基础资料。 方法：采用系统溶剂法对泽漆中的化学成分进行提取和分离；用不同浓度的泽漆石油醚萃取液和氯仿萃取液作用于胃癌SGC-7901、肝癌HepG2、SMMC7721、肺癌A549细胞后,MTT法观察药物对肿瘤细胞的体外生长抑制作用；倒置显微镜观察细胞的形态学改变；透射电子显微镜观察细胞超微结构的变化；流式细胞术分析细胞周期及凋亡；Transwell小室测定药物对肿瘤细胞侵袭力的影响；ELISA法测定细胞培养上清液中MMP-9的相对浓度；RT-PCR测定药物处理前后肿瘤细胞中Caspase3、Bcl-2、Bax、Fas、Cytochrome C和P53 mRNA含量的变化。采用反相高效液相色谱法,色谱柱为TC-C18柱(250mm×4.6 mm,5μm),流动相为甲醇-0.2%磷酸(65:35),流速为1.0 mL-min-1,柱温为30℃,检测波长为360 nm,对泽漆的化学成分进行分离鉴定,并对其主要活性成分进行含量测定。采用火焰原子吸收法测定泽漆中铁、锌、铜、锰元素的含量；石墨炉原子吸收法测定泽漆中铅、镉元素的含量；原子荧光光度计法测定泽漆中砷、汞元素的含量。 结果：400μg·mL-1的泽漆氯仿萃取液作用72h后肝癌HepG2、SMMC7721、胃癌SGC-7901、肺癌A549细胞的增殖抑制率依次为48.3%、86.4%、48.3%、25.8%。泽漆石油醚萃取液对肝癌HepG2、SMMC7721、胃癌SGC-7901、肺癌A549细胞的体外增殖抑制率均小于30%。经400μg·mL-1的泽漆氯仿萃取液和石油醚萃取液作用48 h后,普通倒置显微镜下观察,胃癌SGC-7901、肝癌HepG2、SMMC7721、肺癌A549细胞体积变小,失去固有形态,呈圆形或不规则形；细胞间连接减少；胞内出现颗粒样物质；培养液中悬浮细胞增多。透射电子显微镜下观察,核内染色质浓缩,聚集于核膜下；胞内出现脂肪空泡和自噬体；线粒体和内质网肿胀。经300μg·mL-1和400μg·mL-1的泽漆氯仿萃取液分别作用24 h和48 h后,胃癌SGC-7901、肝癌HepG2、SMMC7721细胞均呈现细胞周期阻滞,具体表现为G0/G1期细胞增多,G2/M期细胞相应减少,使其发生G0/G1期阻滞,并诱导细胞凋亡。400μg-mL-1的泽漆氯仿萃取液作用24 h后SMMC7721、SGC-7901、HepG2细胞的凋亡率分别为1.518%、11.361%、18.693%；48 h后SMMC7721、SGC-7901细胞的凋亡率分别为26.738%、18.28%。经300μg·mL-1的泽漆氯仿萃取液作用48 h后,胃癌SGC-7901、肝癌HepG2、SMMC7721细胞侵袭抑制率分别为25.5%、20.4%、21.0%；细胞培养上清液中的MMP-9浓度分别为46.5±2.14 ng-mL-1、29.3±3.01 ng-mL-1、31.8±1.95 ng-mL-1; 400μg·mL-1的泽漆氯仿萃取液作用48 h后,胃癌SGC-7901、肝癌HepG2、SMMC7721细胞侵袭抑制率分别为46.5%、40.7%、35.6%；细胞培养上清液中的MMP-9浓度分别为33.1±2.33 ng-mL-1、18.5±2.98 ng-mL-1、26.8±2.29 ng-mL-1.经过泽漆氯仿萃取液作用48 h后,胃癌SGC-7901、肝癌SMMC7721、HepG2细胞中P53、Bax、Cytochrome C、Caspase3、Fas mRNA的表达量较对照组升高,Bcl-2 mRNA的表达量较对照组降低,Bax/bcl-2比值升高。泽漆不同部位的槲皮素含量依次为叶根茎,以泽漆叶中槲皮素含量最高,达1.42 mg·g-1；不同采集时间泽漆中槲皮素的含量依次为六月七月八月,以六月份采集标本中槲皮素含量最高,达3.57 mg·g-1。甘肃地产泽漆中微量元素铁、锌、铜、锰含量分别为713.4677μg·g-1、23.9684μg·g-1、18.4504μg·g-1、257.4068μg-g-1；重金属元素铅、镉、砷、汞含量分别为2666.8877 ng·g-1、127.1414 ng·g-1、0.4918μg·g-1、0.2098μg·g-1。 结论：(1)泽漆石油醚萃取液、氯仿萃取液对肝癌SMMC7721、HepG2、胃癌SGC-7901、肺癌A549细胞的形态学和超微结构均有显著影响。(2)泽漆氯仿萃取液对肝癌SMMC7721、HepG2、胃癌SGC-7901细胞有较显著的体外增殖抑制作用。其中对肝癌SMMC7721细胞的增殖抑制作用最强,对肺癌A549细胞增殖抑制作用最弱。对四种肿瘤细胞的增殖抑制率依次为SMMC7721SGC-7901HepG2A549,此作用呈浓度依赖性和时间依赖性。(3)泽漆氯仿萃取液对肝癌SMMC7721、HepG2、胃癌SGC-7901细胞具有一定的细胞周期阻滞作用,随着药物浓度的增加,阻滞作用增强,呈现一定的剂量-效应关系。(4)泽漆氯仿萃取液具有诱导肝癌SMMC7721、HepG2、胃癌SGC-7901细胞凋亡的作用。(5)泽漆氯仿萃取液可能通过抑制细胞培养上清液中MMP-9的表达而抑制肝癌SMMC7721、HepG2、胃癌SGC-7901细胞的侵袭能力。(6)泽漆氯仿萃取液通过线粒体途径和死亡受体途径诱导肿瘤细胞凋亡。(7)槲皮素是泽漆的主要活性成分之一,泽漆中槲皮素的含量可作为药物质量控制的一个指标；泽漆叶为槲皮素类黄酮化合物的最佳原料,六月为最佳采集时间。(8)泽漆中铁、锌、铜、锰元素含量偏低；铅、镉、砷、汞元素参照药用植物及制剂进出口绿色行业标准未超标,可能不是泽漆毒性成分来源。