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藏药胡黄连活性成分的提取分离及药理学研究

赵多明  
【摘要】:目的分离提取西藏胡黄连中活性成分胡黄连苷Ⅱ,研究胡黄连苷Ⅱ样品对实验性脑缺血的保护作用和分子机制,为进一步开发利用西藏胡黄连和开发治疗脑缺血的创新药物提供实验依据。 方法(1)取西藏地产胡黄连干燥根茎500g在常温条件下用70%的乙醇浸渍法获得胡黄连乙醇总提取物。经大孔树脂吸附法和硅胶柱层析法等色谱技术进行分离,合适梯度洗脱,高效液相色谱法测定胡黄连苷Ⅱ含量。(2)采用改良线栓法制作大鼠大脑中动脉缺血再灌注模型,模型鼠随机分成4组,经尾静脉注射胡黄连苷Ⅱ:低剂量组(10 mg/kg)、高剂量组(30 mg/kg),阳性药物组,银杏叶提取物注射液(10mg/kg),阴性对照组注射生理盐水。于缺血再灌注24 h后评价神经行为功能评分和提高躯体摆动实验(EBST),测定脑匀浆上清超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量、还原型谷胱甘肽含量、一氧化氮合酶(NOS)活性等。氯化三苯基四氮唑(TTC)染色观察脑梗死体积并运用image proplus6.0图像分析软件对其评价;苏木素-伊红(HE)染色观察脑组织病理学改变;用免疫组化染色并半定量分析bcl-2和caspase-3的阳性表达。(3)以依达拉奉为阳性对照,采用DPPH法测定胡黄连苷Ⅱ的抗氧化活性。(4)建立体外原代培养神经元自由基损伤模型,给药后利用倒置显微镜下观察神经元生长情况和细胞形态,噻唑蓝(MTT)法检测样品对原代培养神经元活力的影响。 结果(1)HPLC结果分析表明F3组分含胡黄连Ⅱ最高,杂质较少。其纯度约为91.60%。(2)建立胡黄连ⅡHPLC分析方法标准曲线,r=0.9999,浓度范围29.5~236μg/mL。(3)脑缺血再灌注后,大鼠出现神经功能障碍,缺血侧脑组织出现梗死灶,与模型组比较,胡黄连苷Ⅱ治疗组神经功能评分和对侧旋转次数水平降低,差异有统计学意义(P0.05或P0.01)。(4)病理学研究显示病灶处皮层神经元肿胀坏死有所减轻;脑匀浆上清SOD活性和GSH含量明显升高,MDA含量显著降低(P0.01); T-NOS、iNOS、cNOS活性均明显降低,(P0.01或P0.001)。(5)脑梗死体积及脑梗死区域内的caspase-3表达水平均降低,bcl-2阳性表达水平均增高(P0.05)。(6)胡黄连苷Ⅱ有清除DPPH自由基的能力。(7)胡黄连苷Ⅱ可促进受损神经元的生长,具有神经营养作用。 结论(1)胡黄连苷Ⅱ样品中主要成分为胡黄连连Ⅱ,其纯度约为91.65%。(2)胡黄连苷Ⅱ明显改善MCAO/R模型大鼠运动功能,减轻了中枢神经系统病变,可提高脑组织的抗氧化能力,减少脑缺血再灌注所致的氧化损伤。胡黄连苷Ⅱ可减少脑缺血再灌注大鼠脑梗死体积,可以明显促进大鼠缺血区脑组织抑凋亡蛋白bcl-2的表达,同时降低促凋亡蛋自caspase-3的表达,这可能是胡黄连苷Ⅱ减轻脑缺血损伤的机制之一。(3)胡黄连苷Ⅱ是可能是西藏胡黄连药材抗氧化活性成分之一。(4)胡黄连苷Ⅱ没有明显提高细胞的存活率但是改善了损伤神经元的形态。


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