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《兰州大学》 2011年
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白沙蒿铁蛋白基因的克隆及其RNAi载体的构建

陈丽萍  
【摘要】:白沙蒿{Artemisia sphaerocephala Krasch),又名籽蒿或黄毛菜籽,作为沙地植被主要的优势种和建群种,是理想的抗旱、防沙及固沙植物。铁蛋白(ferritin)是一种铁结合和存储蛋白,广泛存在于植物、动物和微生物体内,是生物体内一种保守性较高的多功能多亚基蛋白。近年来铁蛋白基因作为提高生物体内铁含量、调控铁生物功能、抵抗外界环境胁迫、预防生物缺铁性病症的发生而备受关注。本文以野生植物资源白沙蒿为实验材料,从中克隆出铁蛋白基因(AsFer),并构建了特异性沉默基因的RNAi表达载体,这为研究该基因的生理生化特性与功能以及其在逆境条件下的牧草抗逆机制提供材料,对牧草及其抗逆基因工程领域的研究具有重要意义。 论文取得了如下的主要研究结果: 1.根据NCBI公布的植物铁蛋白基因设计简并引物,以白沙蒿叶片为试验材料,采用RT-PCR方法克隆出白沙蒿铁蛋白基因的核心片段,再利用RACE方法获得该目的基因的3’和5’片段,通过序列拼接得到该基因的cDNA序列全长,并命名为AsFer (GenBank No.GQ871941)。 该cDNA全长为1113bp,包括741bp的开放阅读框(ORF)、编码了247个氨基酸,起始密码子A前面有57bp长的5’非翻译区,编码区后有315bp包含poly(A)的3’非翻译区。该cDNA编码的247个氨基酸,具有铁蛋白类似的双铁结构域(蛋白的94-247个氨基酸),以及铁蛋白的铁结合区域特征(蛋白的214-234个氨基酸)。白沙蒿AsFer与其它植物Fer的同源性比较高,比较发现,白沙蒿铁蛋白基因与加拿大乍蓬(Conyza canadensis,) Fer的同源性最高(88.2%);其次是大显(Glycine max) SFerH-3(79.2%),接下来依次是大豆SFerH-4(77.4%),豇豆(Vigna unguiculata)ferritin(77.3%)烟草(Nicotiana tabacum) Fer2(76.5%),麻疯树Jatropha curcas) ferritin2 (76%),马铃薯(Solanum tuberosum) ferritin (76%)。白沙蒿铁蛋白的氨基酸中大部分为亲水性氨基酸,预测其二级结构中含有56.68%α-螺旋,26.72%无规则卷曲,12.55%延伸链和4.05%β-转角。 2.以白沙蒿铁蛋白基因为靶基因,构建使该基因特异性沉默的RNAi表达载体。从AsFer基因的开放阅读框内,选择370bp的目的片断构建回文序列,并以载体pHANNIBAL为基本骨架,表达载体的功能区由CAMV35S启动子引导,正义和反义片段之间由PDK intron隔开,终止子是章鱼碱合成酶的终止序列。将构建好的含有发卡结构的中间载体AsFer (+)/pHANNIBAL/AsFer (-)插入双元植物表达载体pART27中,构建了白沙蒿铁蛋白基因RNAi表达载体pRNAi/AsFer。 用冻融法将重组质粒pRNAi/AsFer导入农杆菌GV1301,获得了pRNAi/AsFer农杆菌GV1301工程菌。 3.构建白沙蒿组培再生体系,将构建好的表达载体pRNAi/AsFer,利用叶盘法转化白沙蒿,通过组织培养,Spec抗性筛选等以获得转基因幼苗。
【学位授予单位】:兰州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:Q943.2

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【引证文献】
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