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《兰州大学》 2011年
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甘肃陇南宫颈癌人乳头瘤病毒感染的区域特征及药物防治研究

王芳  
【摘要】:宫颈癌的发病率在女性肿瘤中位居第二,是全世界最常见的癌症之一。我国宫颈癌的发病率和死亡率约占全世界的1/3,其中甘肃陇南地区的死亡率高达39/10万。研究证实,高危型人乳头瘤病毒(HPV)感染是宫颈癌的根本致病原因,HPV的亚型分布随不同的地理位置和不同的种族而存在差异,而HPV16和HPV18与65%-70%的宫颈癌发病有关。目前临床多采用的手术切除、药物化疗、放射治疗等方法治疗宫颈癌,常常导致患者器官功能严重的缺陷或障碍,引发药物毒副反应及存在多药耐药等,使其在临床中应用受限。因此,阻断高危型HPV感染而防治宫颈癌的技术研究成为当前妇科的热门课题之一。如果能掌握甘肃陇南地区宫颈癌患者HPV感染现状及其亚型分布,筛选出与此地区宫颈癌组织中差异表达的基因,从分子水平探讨甘肃陇南地区HPV感染导致宫颈癌的发病机制,并通过筛选分离提取西北特色药用植物的抗肿瘤活性和抗HPV活性的单体成分,在实验研究的基础上,确定其对HPV的阻断机理,将会是宫颈癌防治工作的一大突破。 本研究①收集2008年5月-2010年5月在甘肃陇南地区4所县级医院病理科保存的宫颈癌患者的石蜡组织标本216例,从组织中提取DNA后PCR扩增,其产物在基因芯片上进行杂交,检测已知的21种HPV亚型。②对于病理已确诊的甘肃陇南地区3例HPV16亚型感染的宫颈鳞癌妇女,同时取宫颈癌组织及自身正常宫颈组织标本,用含21522条人类全基因的Oligo DNA微阵列芯片筛选出差异表达的基因并进行生物功能分析。③培养三种人宫颈癌细胞株(其中HeLa携带HPV18基因,SiHa携带HPV16基因,C33A无HPV基因感染),MTT法检测苦参碱对三种宫颈癌细胞的作用效应;电镜和Hoechst 32258染色观察苦参碱干预后三种宫颈癌细胞的超微结构的变化;流式细胞仪检测经苦参碱干预后三种宫颈癌细胞细胞周期以及凋亡的变化;实时荧光定量PCR法检测苦参碱干预后三种宫颈癌细胞中E6,E7,p53 mRNA的表达情况;Western blotting检测苦参碱干预后三种宫颈癌细胞中E6, E7, P53, IκBα, p-IκBα, NF-κBp65和p-NF-κBp65蛋白的表达情况。④对西北特有的罂粟科秃疮花属植物秃疮花全草的植物化学成分进行分析研究,并对提取的化合物进行抑制HPV药效的计算机分子对接研究。 本研究结果表明:①基因芯片可检测出多种HPV亚型,特异性强,敏感性高,对宫颈癌致病机制的研究及其预防具有重要意义。甘肃陇南地区高危型HPV感染率为87.03%(188/216),低危型HPV检出率为2.78%(6/216),HPV16为主要致病亚型,占50.53%(95/188),HPV58为第二致病亚型,占21.81%(40/188),HPV33感染率为11.18%(21/188),HPV18感染率为9.57%(18/188)。单一感染140例,占72.16%(140/194),混合感染54例,占27.83%(54/194),其中40例为双重感染,占20.62%(40/194),另14例为多重感染,占7.21%(14/194)。陇南地区HPV感染的分布资料不仅为此地区宫颈癌的诊断、治疗提供依据,也为设计适合该地区的HPV疫苗积累基础数据。②基因芯片筛查出甘肃陇南地区HPV16亚型感染的宫颈癌组织中差异表达基因有308条,其中126条上调,182条下调。这些基因的功能涉及原癌基因和抑癌基因、细胞骨架结构、转运载体、细胞信号转导、转录调控、细胞粘附、新陈代谢、免疫相关以及细胞凋亡,若能继续深入研究,有望明确甘肃陇南地区宫颈癌高发病率的分子机制。③MTT实验检测结果显示苦参碱能够抑制三种人宫颈癌细胞的增殖,且存在剂量与时间的依赖关系;电镜及Hoechst 32258染色对形态学的观察发现凋亡细胞及特征性的凋亡小体;流式细胞检测结果显示经苦参碱处理后,三种细胞的G1期和G2期细胞百分比逐渐减少,S期细胞百分比逐渐增多,存在剂量效应;实时PCR检测结果显示苦参碱处理后的三种人宫颈癌细胞中E6、E7mRNA的表达降低;westblotting检测E6,E7,p53,IκBα, p-IκBα, NF-κBp65和p-NF-κBp65蛋白的表达显示苦参碱能使人宫颈癌细胞中E6,E7蛋白表达降低,p53的表达显著升高(P0.05),IκBα和NF-κBp65的表达变化不大,但p-IκBα,和p-NF-κBp65蛋白的量却增加(P0.05),其中cleaved-caspase3表达在C33A细胞中表达升高最为明显(P0.05)。由此推断苦参碱在体外能够抑制三种人宫颈癌细胞的增殖;对于HPV感染的细胞通过抑制E6、E7癌基因的表达,上调p53的表达水平,触发p53和NF-κB分子各自级联的下游分子,活化NF-κB分子通路在核内的转录水平,介导NF-κB参与凋亡途径的发生。但对HPV非感染的细胞C33A,NF-κB信号通路并不介导其中,而是通过其他凋亡途径调控细胞凋亡。④秃疮花全草中分离出一种新的何帕烷类三萜化合物秃疮花酮,其可能通过抑制HPV E6蛋白的活性位点达到抑制HPV的药效作用。
【学位授予单位】:兰州大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2011
【分类号】:R737.33

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