硫化氢诱导的水稻悬浮细胞培养物交替氧化酶基因表达及氧化还原状态变化
【摘要】：本研究以水稻为实验材料,成功地建立了愈伤组织培养物和悬浮细胞培养物体系。以悬浮细胞培养物为实验材料,NaHS (H2S供体)为处理试剂,重点分析了水稻悬浮细胞培养物在不同浓度、不同处理时间下交替氧化酶的表达情况、抗氧化酶(SOD, POD, CAT, APX)的活性变化情况、氧化还原平衡以及细胞活力情况,主要的实验结果总结如下：
1、H2S处理增强了水稻悬浮细胞培养物交替途径实际运行活性。当用H2S处理水稻悬浮细胞培养物4小时后,水稻悬浮细胞培养物培养物交替途径实际运行活性急剧增加,并且在2mM NaHS的处理剂量下达到最高值,但是随着NaHS(5-10mM)处理剂量的增加,交替途径实际运行活性下降并维持在一个稳定的水平。
2、采用半定量RT-PCR方法对交替氧化酶Aoxl基因家族中Aoxla, Aoxlb, Aoxlc的表达调控情况进行分析,结果显示：Aoxl基因家族转录水平的变化与交替途径实际运行活性变化相似。H2S处理水稻悬浮细胞培养物培养物后,Aoxla, Aoxlb, Aoxlc都表达,但表达的条件和形式各不相同。在正常水稻悬浮细胞培养物培养物中,Aoxla和Aoxlb都表达,Aoxlc不表达。当用NaHS处理后,水稻悬浮细胞培养物培养物中Aoxla的转录水平在0.5mM处理剂量下迅速增加并维持稳定的水平；Aoxlb的转录水平增加,并在2mM达到最高值,其表达量大约为对照细胞的2倍；Aoxlc的表达随着处理浓度的增加而增加,并且在10mM达到最高值。这三个基因表达条件和形式的不同显示出H2S可以作为调节因子精确地调节植物Aoxl基因的表达,从而达到控制植物抗氰呼吸运行的目的。
3、H2S处理水稻悬浮细胞培养物引起了过氧化氢含量及活性氧的各种清除酶类活性发生变化。在低剂量NaHS (≦2mM)处理水稻悬浮细胞培养物2小时后,过氧化氢含量达到最低值,CAT, APX晦的活性达到最高值；当低剂量Na2HS((?)2mM)处理水稻悬浮细胞培养物4小时后,SOD酶达到最高,此时过氧化氢含量维持在低水平；在高剂量NaHS ((?)5mM),长时间处理水稻悬浮细胞培养物时,CAT酶活性高于对照,而APX酶,SOD、POD酶活性低于对照,过氧化氢含量增加明显。我们推测H2S可以作为调节因子,通过调节过氧化氢含量来调控抗氧化物酶的活性。
同时,H2S可以引起植物细胞内GSH含量以及GSH/GSSG比值的变化。结果显示：水稻悬浮细胞培养物在低剂量((?)2mM)的NaHS处理下,细胞内GSH含量增加,在2mM的NaHS处理下,细胞内GSH含量达到最高值。GSH/GSSG比值随处理时间的增加呈现出先升后降的趋势,在2小时时GSH/GSSG达到最大。在高剂量的NaHS处理下,GSH/GSSG的比值呈下降趋势。综合H2S对水稻悬浮细胞培养物引起的过氧化氢含量变化的分析结果可以推测：H2S可以通过调节过氧化氢的含量来对植物细胞中的GSH/GSSH的氧化还原平衡进行调节。
4、通过荧光显微镜对水稻悬浮细胞培养物进行观测、TTC和Evans blue对水稻悬浮细胞培养物活力进行检测后,发现低剂量(0.5-2mM)的NaHS处理水稻悬浮细胞培养物4小时后,细胞活力明显升高,并且当处理剂量为2mM时达到最高值；当高处理剂量处理水稻悬浮细胞培养物时,细胞活力减少,同时出现了大量的细胞死亡,这一实验结果与GSH/GSSG比值变化相一致,因此我们可推测对GSH/GSSG增加会导致植物细胞活力的增加。
【关键词】：硫化氢气体 水稻悬浮细胞培养物 交替氧化酶 过氧化氢 【学位授予单位】：兰州大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2012
【分类号】：S511;Q943
【目录】：
- 缩写词3-5
- 中文摘要5-7
- Abstract7-13
- 第一章 文献综述13-47
- 1.1 硫化氢气体在动物体内的研究13-26
- 1.1.1 硫化氢的性质13-14
- 1.1.2 硫化氢的毒性14-16
- 1.1.3 硫化氢作为信号分子16-26
- 1.2 硫化氢气体在植物中的研究概况26-28
- 1.2.1 硫化氢对植物的毒害作用26
- 1.2.2 硫化氢在植物中的新陈代谢26-27
- 1.2.3 植物体内内源性硫化氢的生成27
- 1.2.4 硫化氢气体在植物中作为信号物质存在的可能调节机制27-28
- 1.3 植物的交替氧化酶和交替途径28-37
- 1.3.1 交替氧化酶具有的生理功能29-33
- 1.3.2 交替氧化酶的特征及调节机制33-35
- 1.3.3 交替氧化酶的基因表达差异35-37
- 1.4 植物中的过氧化氢37-41
- 1.4.1 H_2O_2的生成和在信号转导中的作用37-39
- 1.4.2 活性氧的清除39-41
- 1.5 谷胱甘肽与细胞内的氧化还原平衡41-44
- 1.5.1 谷胱甘肽库调控41-43
- 1.5.2 谷胱甘肽在信号传递中的作用43-44
- 1.5.3 细胞活力与氧化还原平衡44
- 1.6 本课题的立题依据44-46
- 1.7 本课题研究内容46-47
- 第二章 硫化氢对抗氰交替途径,交替氧化酶诱导及交替氧化酶基因的表达的调控47-56
- 2.1 材料与方法47-49
- 2.1.1 水稻胚性愈伤的诱导47
- 2.1.2 水稻胚性细胞悬浮系的建立47-48
- 2.1.3 植物材料的处理48
- 2.1.4 Clark氧电极法的测定组织呼吸48
- 2.1.5 水稻总RNA的提取48
- 2.1.6 半定量RT-PCR48-49
- 2.2 结果和分析49-53
- 2.2.1 不同时间下不同剂量的硫氢化钠对水稻悬浮细胞培养物抗氰呼吸的影响49-51
- 2.2.2 不同浓度的硫氢化钠对水稻悬浮细胞培养物处理4小时后呼吸电子流的影响51
- 2.2.3 交替氧化酶Aoxl家族的表达分析51-53
- 2.3 讨论53-56
- 第三章 硫化氢处理下植物中过氧化氢的产生和清除56-65
- 3.1 材料和方法56-57
- 3.1.1 材料56
- 3.1.2 过氧化氢含量的测定56
- 3.1.3 酶液提取56
- 3.1.4 抗氧化酶活性的测定56-57
- 3.2 结果和分析57-62
- 3.2.1 H_2O_2的变化57-58
- 3.2.2 APX活性的变化58-59
- 3.2.3 POD活性的变化59-60
- 3.2.4 SOD活性的变化60-61
- 3.2.5 CAT活性的变化61-62
- 3.3 讨论62-65
- 第四章 硫化氢对植物细胞谷胱甘肽含量及对细胞活力的影响65-74
- 4.1 材料与方法65-66
- 4.1.1 材料65
- 4.1.2 谷胱甘肽含量测定65
- 4.1.3 TTC测定细胞活力65-66
- 4.1.4 植物细胞荧光显微观测66
- 4.2 结果与分析66-71
- 4.2.1 谷胱甘肽含量测定66-68
- 4.2.2 细胞活力测定68-69
- 4.2.3 荧光显微观测69-71
- 4.3 讨论71-74
- 结论74-77
- 参考文献77-91
- 在学期间的研究成果91-92
- 致谢92
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