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《兰州大学》 2012年
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芦丁的抗缺氧作用及其分子机制研究

姚娟  
【摘要】:1.建立PC12细胞缺氧模型,观察缺氧环境对PC12细胞的损伤作用,筛选芦丁作用于缺氧PC12细胞的最佳浓度,研究芦丁对缺氧PC12细胞的保护机制。 2.建立H9c2细胞缺氧模型,观察缺氧环境对H9c2细胞的损伤作用,筛选芦丁作用于缺氧H9c2细胞的最佳浓度,研究芦丁抗H9c2细胞缺氧损伤的初步机制。 3.观察芦丁对缺氧H9c2细胞NOS-NO-sGC-cGMP的影响,探讨芦丁激活NO信号途径保护H9c2细胞缺氧损伤的可能机制。 方法 1.缺氧培养PC12细胞,筛选芦丁作用于缺氧PC12细胞的最佳浓度,并观察缺氧前后细胞形态,测定细胞活力、LDH含量、细胞周期、实时荧光定量PCR检测HIF-la及Caspase-3mRNA的表达水平,提取总蛋白,Western-blot法检测HIF-la蛋白的表达。 2.缺氧培养H9c2细胞,筛选芦丁作用于缺氧H9c2细胞的最佳浓度,并观察缺氧前后细胞形态,测定细胞活力、LDH含量、实时荧光定量PCR检测HIF-la、 VEGF、HO-1、Caspase-3mRNA的表达水平。 3.用L-NAME、Carboxy-PTIO和ODQ分别阻断eNOS、NO和sGC,观察芦丁对缺氧环境下未阻断和阻断后eNOS、NO、sGC和cGMP的变化,并检测各组LDH、CK、ATP的含量变化,使用实时定量PCR检测HIF-la、VEGF、 HO-1、Caspase-3、Bcl-2、Mb及Tnn mRNA的表达水平。 结果 1.缺氧环境对PC12细胞的活性有明显的抑制作用,缺氧培养48h时能够明显抑制PC12细胞的活性。芦丁作用于缺氧PC12细胞的终浓度为1×10-5mol·L-1时能够极显著提高其活力。 芦丁作用于缺氧PC12细胞的终浓度为1×10-5mol·L-1时能够明显降低培养基中LDH的含量,具有保护缺氧细胞膜功能完整性的作用。缺氧48h后,PC12细胞G1期比例与正常组相比明显降低,S期细胞比例升高。与缺氧模型组比较,终浓度为1×10-5mol·L-1的芦丁作用于缺氧PC12细胞48h后G1期细胞比例升高、S期细胞比例下降。 芦丁能够诱导缺氧PC12细胞HIF-lamRNA表达增高,芦丁组在缺氧12h、24h和48h后与缺氧模型组相比能够极显著提高HIF-lamRNA的表达水平;缺氧12h、24h和48h时芦丁组与缺氧模型组相比能够极显著降低Caspase-3mRNA的表达水平;缺氧处理48h后,HIF-la蛋白的表达水平升高,芦丁组与缺氧模型组相比,芦丁组HIF-la蛋白的表达高于缺氧模型组。 2.缺氧环境对H9c2细胞活性有明显的抑制作用,缺氧48h时H9c2细胞的活性受到明显的抑制。芦丁作用于缺氧H9c2细胞的终浓度为1×10-5mol·L-1时能够极显著提高细胞的活力。 芦丁作用于缺氧H9c2细胞的终浓度为1×10-5mol·L-1时与缺氧模型组相比培养基中LDH的含量明显降低。 芦丁能够诱导缺氧H9c2细胞HIF-la和VEGF mRNA表达增高,提高缺氧环境下H9c2细胞HO-1mRNA的表达,降低Caspase-3mRNA的表达。 3.缺氧可以诱导H9c2细胞中eNOS的活性明显上升,在缺氧12h、24h和36h时明显高于正常对照组,其中缺氧12h时差异最为明显,缺氧12h时H9c2细胞中NO的含量极显著升高。 芦丁作用于H9c2细胞的终浓度为1×10-5mol·L-1时,能够提高L-NAME阻断后缺氧H9c2细胞中eNOS的活性及eNOS蛋白的表达量,亦能升高NO的含量。芦丁能够升高经Carboxy-PTIO阻断后缺氧H9c2细胞sGC基因的表达水平,能够升高ODQ阻断后缺氧H9c2细胞cGMP的生成量。 芦丁能够降低缺氧H9c2细胞培养上清中LDH和CK的含量,降低H9c2细胞中ATP的含量。芦丁能够提高HIF-la、VEGF和HO-1mRNA的表达水平,降低Caspase-3mRNA的表达水平,对Bcl-2mRNA表达水平的影响无统计学差异,能够升高缺氧H9c2细胞中Mb和Tnn mRNA的表达水平。结论 1.芦丁具有显著抗PC12细胞缺氧损伤的作用,其机制可能是通过提高细胞活性、保护细胞膜功能完整性、影响细胞周期、在缺氧后期提高HIF-la mRNA和蛋白的表达及抗凋亡来实现的。 2.芦丁对缺氧H9c2细胞具有明显的保护作用,其抗缺氧机制可能与提高细胞活性、保护细胞膜功能完整性、在缺氧后期提高HIF-la、VEGF和HO-1mRNA的表达及抑制凋亡有关。 3.芦丁对缺氧H9c2细胞具有明显的保护作用,其机制可能是通过激活eNOS-NO-sGC-cGMP信号通路引起的。
【学位授予单位】:兰州大学
【学位级别】:硕士
【学位授予年份】:2012
【分类号】:R285

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【参考文献】
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