牦牛Ghrelin基因的克隆及其在“下丘脑—垂体—胃”轴上的表达机理

【摘要】：为了研究牦牛对其极端漫长、牧草短缺及高寒采食环境的适应机理,进一步明晰高原草食动物对青藏高原高寒草甸生态环境适应的调控机理,本论文以牦牛为研究对象(黄牛为对照),运用基因克隆、免疫组化及生物信息学分析软件等技术和方法,通过对牦牛胃饥饿素(Ghrelin)基因的克隆、氨基酸序列对比与分析及其在消化轴“下丘脑-垂体-胃”轴中的定位及定量分析,探讨了牦牛对饥饿抗性的调控机理。 具体研究结果如下： 1.初次克隆出牦牛Ghrelin基因的部分片段,该片段核酸序列长度为475bp,编码159个氨基酸,其基因序列的提交号为bankit1391517。其与黄牛的相应cDNA同源性分别为95%；在该牦牛Ghrelin基因的核酸序列中,有4处缺失位点：5bp、13bp、281bp及282bp；6处转换位点：153bp:C→T,154bp: A→G,194bp:T→C,253bp:G→A,309bp:C→T,472bp: C→T;3处颠换位点：340bp:C→G,441bp:G→C,473bp:T→G. 2.在牦牛下丘脑、垂体及胃不同器官组织中Ghrelin阳性反应产物的表达面积(S)和累计光密度值(IOD)均显著地高于黄牛相应表达部位的(P0.01)：1)在下丘脑中,Ghrelin阳性神经元主要分布于下丘脑弓状核(ARC)、腹内侧核(VMN)及背内侧核(DMN),其S和IOD值也有一定规律的特征：SARCSVMNSDMN和IODARCIODvmnIODDMN(P0.01);2.在脑垂体中,只有腺垂体有Ghrelin免疫反应阳性产物分布,而在神经垂体和中间部尚未见其阳性产物的分布；3)在胃中,Ghrelin阳性反应产物分布在皱胃体、幽门区和贲门区,而在瘤胃、瓣胃和网胃中,未见到Ghrelin阳性产物的分布,且在表达的不同部位组织中,其S和IOD值的表达规律为S皱胃体S幽门区S贲门区和IOD皱胃体IOD幽门区IOD贲门区(P0.01)。 结论：牦牛Ghrelin基因的核酸序列与黄牛的相比具有较高的同源性,该基因在进化中高度保守；在牦牛下丘脑核团中,Ghrelin主要在弓状核、腹内侧核及背内侧核中高表达,在中枢神经系统调控动物摄食行为、维持体重平衡和能量代谢中发挥着非常重要的作用；在牦牛垂体和胃中高表达的内源性Ghrelin是以自分泌和旁分泌方式参与食欲调控和维持能量代谢的。总之,在牦牛“下丘脑-垂体-胃”轴中Ghrelin基因的高表达可能是牦牛适应青藏高原高寒、低氧等极端环境维持体重平衡和能量代谢生理过程的重要机制之一。