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《兰州大学》 2014年
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靶向抑制NOTCH信号通路诱导胃癌细胞凋亡的网络调控研究

刘涛  
【摘要】:目的 NOTCH信号通路在保持细胞增殖、分化和凋亡的平衡等方面都发挥非常重要的作用,目前有大量的研究和临床证据表明NOTCH在许多肿瘤中起原癌基因或者抑癌基因的作用,因此NOTCH通路是肿瘤治疗的一个潜在靶点。我们前期研究发现NOTCH信号通路在胃癌中存在异常表达,本研究探讨靶向抑制NOTCH信号通路应用于胃癌治疗的可能性,同时阐释抑制该信号通路诱导胃癌细胞凋亡的机制,为胃癌的治疗提供新思路和科学依据。 方法 将胃癌重要致癌因子(幽门螺杆菌)H. pylori和正常胃粘膜细胞株共培养24h后,通过RT2Profiler PCR Array-Human Signal Transduction Pathway Finder基因芯片筛选H. pylori感染后出现异常表达的信号通路。将不同H. pylori菌株与胃粘膜细胞共培养后,利用荧光定量PCR和Western Blot验证上一步筛选出的通路。使用NOTCH信号通路抑制剂GSI和受体配体siRNA处理三种胃癌细胞株MKN-45、SGC-7901、BGC-823,利用流式细胞仪Annexin-V-FITC/PI双染法检测抑制Notch信号通路对胃癌细胞周期及凋亡的影响,通过RT2Profiler PCR Array-Human Signal Transduction Pathway Finder基因芯片分析胃癌细胞中NOTCH信号通路与其它信号通路的cross-talking,通过Human Apoptosis Antibody Array抗体芯片阐释阻断NOTCH信号通路诱导胃癌细胞凋亡的机制。 结果 正常胃粘膜细胞株与H. pylori11637共培养后,通过RT2Profiler PCR Array-Human Signal Transduction Pathway Finder基因芯片检测有22个基因表达水平具有差异,这些基因主要与细胞增殖、细胞周期和转录调控相关,DAVID Pathway分析显示H. pylori感染后主要影响了Cyclins and Cell Cycle Regulation和NOTCH Signaling Pathway这两条通路。PCR及Western Blot结果验证了H. pylori不同菌株11637和SS1感染胃粘膜细胞后,NOTCH配体DLL4表达水平显著上升。流式细胞仪检测证实两种菌株通过调控细胞周期相关蛋白,抑制了细胞增殖。 使用20μmol/L GSI (S2188)作用于胃癌细胞株BGC-823、MKN-45、 SGC-790124h后受体NOTCH1、NOTCH2和靶基因HES1的mRNA和相应蛋白表达水平都显著受到了抑制;抑制剂使得胃癌细胞停滞于G1期,阻止细胞DNA合成进而影响其有丝分裂,抑制了细胞的增殖,并且诱导胃癌细胞发生凋亡。NOTCH2siRNA和DLL4siRNA均能显著抑制相应蛋白表达水平,通路靶基因HES1表达水平显著下降,siRNA组胃癌细胞周期无明显变化,但与GSI组相同显著诱导了胃癌细胞的凋亡。采用Array-Human Signal Transduction PathwayFinder分别对GSI、NOTCH2siRNA和DLL4siRNA处理后的胃癌细胞MKN-45进行基因表达分析发现,三组无显著差异,NOTCH信号通路与WNT信号通路、P53信号通路和缺氧信号通路密切相关。Human Apoptosis Antibody Array抗体芯片分别对GSI、NOTCH2siRNA和DLL4siRNA处理后的MKN-45进行蛋白差异表达分析发现,GSI组差异蛋白既含有死亡受体途径的蛋白,同时线粒体凋亡途径中的多个蛋白也上调;siRNA组只有肿瘤坏死因子受体蛋白上调,说明两种抑制方法通过不同机制调控胃癌细胞的凋亡。 结论 NOTCH信号通路可做为胃癌治疗的潜在靶点,靶向抑制NOTCH受体或配体与抑制剂效果相似,其通过调控WNT信号通路、P53信号通路和缺氧信号通路相互作用,使胃癌细胞增殖降低并诱导发生凋亡,其凋亡机制有所差异:配体或受体siRNA通过死亡受体途径,抑制剂GSI通过死亡受体途径和线粒体途径两种方式诱导凋亡。
【学位授予单位】:兰州大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2014
【分类号】:R735.2

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【参考文献】
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【共引文献】
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