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基于代谢组学的中华羊茅-内生真菌共生体响应低温胁迫的生化机制

周连玉  
【摘要】:极端温度、干旱、盐碱、病原菌等严重影响植物生产力,中华羊茅(Festuca sinensis)是一种内生真菌侵染率高的多年生草本植物,具有适口性好、营养价值高、抗寒、抗旱、发病率低等优势。本研究以甘肃夏河、青海玉树和海北三种生态型中华羊茅为试验材料,在低温胁迫下,探讨Epichloe或外源钙对内生真菌生物碱、代谢谱和糖代谢的影响;分离Epichloe并粗提其代谢产物,测定生物活性。本文的主要研究结果如下:1.利用高效液相色谱(HPLC)测定麦角碱含量,结果表明麦角酰胺、麦角新碱和总麦角碱含量在短期(7 d)低温胁迫(5℃、10℃)的三种生态型之间存在显著性差异(P0.05);在5℃时带菌植株(E+)中麦角酰胺、麦角新碱和总麦角碱含量显著高于正常温度下的植株(P0.05)。基于气质联用(GC-MS)的代谢数据,采用主成分分析(PCA)的载荷图表明,一些含氮化合物、酸、糖、醇和未知化合物等24种为分类贡献最大的标志性代谢物,其含量普遍为E+植株中高于E-植株,三种生态型在不同温度环境下代谢谱存在差异性。通过聚类分析,分为三类样品:正常温度下的样品、低温处理后E+样品和低温处理后不带菌植株(E-)样品;不同代谢产物分为两组,一组仅包含8种化合物,另一组包含109种化合物,又划分为三类。研究结果显示,许多代谢产物的变化与植物抗寒性关系密切,为从代谢组学角度筛选抗寒性禾草类牧草品系提供新的思路。2.中华羊茅响应低温胁迫(1±1℃)过程的试验,初步明确了多种目标代谢产物的动态变化。低温胁迫促进三种生态型的多种含氮化合物如谷氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、天冬氨酸、丙氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、GABA等含量增加,两种生态型的多种有机酸在低温胁迫期间稍有下降。三种生态型对正常温度和低温胁迫的反应均不同。然而内生真菌能提高与糖酵解、三羧酸循环和氨基酸合成途径的相关代谢物水平,说明内生真菌能增强中华羊茅的抗寒能力。本试验结果为进一步用代谢组学方法阐释植物抗寒性机制奠定基础。3.通过PCA和聚类分析Epichloe XH03菌株低温代谢谱,结果表明温度显著影响代谢产物的变化,分类贡献率最大的标志性代谢物有一些含氮化合物、糖类、有机酸。尸胺、氨基乙醇、亮氨酸、丝氨酸、焦谷氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、氨基丙二酸、苯丙氨酸等含氮物质在低温条件下增加;果糖、葡萄糖等糖类也在低温下积累,而蔗糖含量降低;低温降低一部分有机酸的含量。本结果为更好理解共生体抗寒性提供科学依据。4.田间严寒试验,外源钙和或Epichloe对三种生态型响应低温胁迫时叶片相对含水量(RWC)、叶绿素、根系活力和糖类物质的影响不一致。随胁迫时间的延长,三种生态型中果糖含量为先升后降,根系葡萄糖含量不断增加。在生态型XH中,Epichloe促进胁迫14d和28 d时RWC、胁迫0d时叶绿素、胁迫0d和14d时根系活力、地上部分可溶性糖和葡萄糖以及胁迫28 d时根系蔗糖含量增加;外源钙促进叶绿素、胁迫28 d时根系活力、地上部分和根系可溶性糖、根系果糖和E+植株地上部分果糖含量上升,促使E+植株地上部分蔗糖含量高于对照E-,降低E+植株RWC,但对类胡萝卜素的影响因胁迫时间和Epichloe而异。在生态型HB中,Epichloe提高胁迫0d和14d时RWC、地上部分果糖和葡萄糖含量,降低胁迫14d和28 d时类胡萝卜素含量;外源钙增加胁迫28 d时叶绿素、类胡萝卜素、地上部分和根系可溶性糖、地上部分和根系果糖、根系葡萄糖、E-植株地上部分葡萄糖和胁迫14 d时RWC、E+植株的根系活力和地上部分蔗糖含量,而降低E+植株中RWC, Epichloe和外源钙协同作用时提高根系蔗糖水平。生态型YS中,Epichloe促进胁迫28 d时RWC、根系活力、根系果糖、地上部分和根系可溶性糖的积累,降低胁迫14d时类胡萝卜素含量:外源钙提高胁迫28 d时RWC、胁迫28 d时E-植株叶绿素和类胡萝卜素、E+植株胁迫14d时类胡萝卜素、根系活力、地上部分和根系可溶性糖、E-植株地上部分果糖和葡萄糖含量,以及E-植株胁迫28 d时蔗糖的积累。这些结果表明了外源钙和或内生真菌能增强植物耐寒力。5.平板对峙培养表明Epichloe XH03对植物病原菌链格孢、离蠕孢和新月弯孢的菌丝生长抑制率至少为50%。利用不同溶剂萃取发酵物获得不同的粗提物进行抗菌活性的结果表明:乙酸乙酯粗提物对链格孢、离蠕孢、新月弯孢和镰刀菌菌丝生长表现出良好的抑制活性。在离体叶片上Epichloe显著减少所测试的病原菌感病率及病斑大小;接种病原菌孢子和乙酸乙酯粗提物的混合液或仅接种病原菌孢子悬浮液于离体叶片上,发现两者的病斑大小存在显著性差异。基于GC-MS检测出Epichloe XH03乙酸乙酯粗提物包含多种化学成分。


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