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基于石墨烯电化学传感器技术及液质联用技术的中药组分分析研究

安婧  
【摘要】:中药活性组分的分析是近年来中药研究领域的热点和难点。一方面,电化学传感器分析技术因具有选择性强、灵敏度高、成本低等诸多优势,在中药活性组分分析方面引起了广泛关注。另一方面,液——质联用(LC-MSn)技术因其强分离能力、高灵敏度、高选择性并能提供相对分子质量和丰富结构信息等特征而被广泛应用于中药活性组分分析及中药药物代谢动力学研究。基于以上两点,本论文的研究内容包括基于石墨烯电化学传感器技术的中药活性组分分析和基于液质联用技术的中药复方药物代谢动力学及其配伍规律的研究。具体研究内容包括:(一)基于石墨烯电化学传感器技术的中药活性组分分析1.构建PDDA功能化的石墨烯膜电化学传感器,并用于中药紫草中紫草素的含量测定采用化学氧化还原法制备了石墨烯(graphene)并使用聚二烯丙基二甲基氯化铵(PDDA)对其进行功能化,得到了新颖的PDDA功能化的石墨烯纳米片(PDDA-GS).将PDDA-GS修饰的玻碳电极用于构建灵敏测定紫草素的电化学传感器。由于修饰电极表面高的紫草素负载量以及石墨烯优异的导电性,紫草素的电化学响应得到了极大的增强从而实现了紫草素的灵敏快速检测。在优化的条件下,该传感器对紫草素检测的线性范围为9.472×10-8 mol-L-1-3.789×10-6 mol·L-1,检测限为(S/N=3) 3.157×10-8mol·L-1.同时,所构建的紫草素电化学传感器还表现出了良好的稳定性、选择性及重现性并能实现中药紫草中紫草素的检测。2.明胶功能化石墨烯的绿色合成及其在细胞内的药物转运研究采用简单、环境友好的合成方法,以明胶还原剥离氧化石墨烯,制备了明胶功能化的石墨烯纳米片(gelatin-GNS)。由于gelatin-GNS具有独特的单层性质以及大的比表面积,能与药物发生强烈的Aπ-π共轭相互作用,实现药物的高效负载,gelatin-GNS被用于研究细胞成像和胞内药物运输。结果表明,gelatin-GNS对人肺癌细胞(A549)是无毒的。MTX@gelatin-GNS的药物运输过程可能经历了细胞的非特异性内吞机理;MTX的pH依赖型释放行为提示其在细胞中的释放可能经历了明胶调节的缓释过程。因此,gelatin-GNS可以作为一种理想的药物载体用于药物运输和控释。(二)基于液质联用技术的中药复方药物代谢动力学及其配伍规律的研究。青娥方系补肾壮骨经典方,由君药杜仲(盐制)、臣药补骨脂(盐制)、佐药核桃仁(炒制)和使药大蒜四味中药组成。基于药效学的青娥方复方配伍规律研究已有报道,但是基于药物代谢动力学的配伍规律研究尚未见报道。具体研究内容如下:1.青娥方君药杜仲中入血成分研究运用UPLC-MS/MS技术构建了杜仲中18种活性成分(木脂素类:松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇单糖苷、丁香素、Lirioresinol-A、松脂素、表松脂素、中脂素;环烯醚萜类:京尼平苷、京尼平苷酸、桃叶珊瑚苷;酚醛树脂类:绿原酸、芥子醛、松柏醛;黄酮及黄酮醇类:芦丁、槲皮素、紫云英苷、山奈酚;其他类:5-羟甲基糠醛)的色谱及质谱条件,并用于大鼠灌胃给予杜仲提取物后,血浆中入血成分的检测。发现共有9种成分入血,具体包括:松脂醇二葡萄糖苷、松脂醇单糖苷、表松脂素、丁香素、桃叶珊瑚苷、京尼平苷、京尼平苷酸、绿原酸、5-羟甲基糠醛。2.青娥方君药杜仲中主要活性成分的药物代谢动力学研究以入血成分的研究结果为基础,进一步优化杜仲入血成分的UPLC-MS/MS检测条件,建立并验证了大鼠血浆中松脂醇二葡萄糖苷、京尼平苷、京尼平苷酸、桃叶珊瑚昔、绿原酸这五种成分的UPLC-MS/MS分析方法,并成功用于单次灌胃给予杜仲乙醇提取物后,SD雄性和雌性大鼠体内的药物代谢动力学研究。五种指标成分在雄性、雌性大鼠体内均具有良好的吸收、分布、消除过程,且雄性、雌性大鼠的血浆药时曲线趋势基本一致,但各指标成分在雄性、雌性大鼠中的药动学参数具有明显的差异,雄性大鼠比雌性大鼠表现出了更高的吸收及更慢的消除过程。3.杜仲提取物在正常小鼠与卵巢摘除(OVX)小鼠体内的血浆药物代谢动力学及组织分布比较研究为了探讨杜仲提取物在正常小鼠及雌激素缺乏的病理模型小鼠体内吸收、分布、消除的差异,用已构建的UPLC-MS/MS测定方法,研究单次灌胃给予杜仲提取物后,松脂醇二葡萄糖苷,京尼平苷,京尼平苷酸,绿原酸及桃叶珊瑚苷在正常小鼠和OVX小鼠体内的血浆药代动力学及组织分布差异。发现血浆药代动力学的差异主要表现为:松脂醇二葡萄糖苷、京尼平苷酸、京尼平苷在OVX小鼠中的AUC0-t、AUC0-∞、Cmax明显高于正常组小鼠;Vd和CL明显低于正常组小鼠(p0.05)。绿原酸与之相反,在正常组小鼠血浆中的吸收明显高于OVX小鼠。桃叶珊瑚苷在正常小鼠血浆中测定得到了明确的药时曲线,而在OVX小鼠血浆中并未测得。组织分布的差异主要有:桃叶珊瑚苷在正常组小鼠肝脏中表现出良好的分布,而在OVX小鼠肝脏中没有测到。OVX小鼠肝脏、脾脏、肾脏中松脂醇二葡萄糖苷,京尼平苷,京尼平苷酸的药物分布明显高于正常小鼠,OVX小鼠脾脏中绿原酸的分布低于正常小鼠,但OVX小鼠肝脏、肾脏中绿原酸的分布仍然高于正常小鼠,这一结果表明杜仲提取物中五种指标成分在小鼠肝脏、脾脏和肾脏中均有良好的分布,分布较快且在组织中无蓄积;五种指标成分在卵巢摘除小鼠体内具有更高的生物利用度。另外,指标成分在OVX小鼠子宫中分布较快,在4h内即表现出了二次分布,提示其对子宫的雌激素样作用。4.基于药物代谢动力学的青娥方复方配伍规律研究分别单次灌胃给予SD大鼠以下五种提取物:杜仲、杜仲+补骨脂、杜仲+大蒜、杜仲+桃仁、杜仲+补骨脂+大蒜+桃仁,研究松脂醇二葡萄糖苷、京尼平苷、京尼平苷酸、桃叶珊瑚苷、绿原酸这五种指标成分的药物代谢动力学。结果表明青娥方配伍后五种指标成分在大鼠体内均具有良好的吸收、分布、消除过程,且补骨脂、核桃仁、大蒜与君药杜仲两两配伍以及青娥方全方配伍后,五种指标成分在杜仲单方及青娥方配伍方中的药时曲线趋势基本一致,但杜仲单方组和青娥方配伍组的药代动力学参数具有显著差异。通过比较指标成分分别在五个配伍组中的药动参数AUC0-t、AUC0-∞、Cmax,发现杜仲配伍补骨脂后,松脂醇二葡萄糖苷、京尼平苷酸及京尼平苷在大鼠体内的吸收明显增强,另外,补骨脂能延缓京尼平苷酸及京尼平苷的达峰时间;杜仲配伍核桃仁后,绿原酸、桃叶珊瑚苷在大鼠体内的吸收明显降低;杜仲配伍大蒜后,环烯醚萜类成分京尼平苷酸、京尼平苷及桃叶珊瑚苷在大鼠体内的吸收明显降低;青娥方全方配伍使得绿原酸在大鼠体内的吸收明显增强,而对松脂醇二葡萄糖苷和桃叶珊瑚苷在大鼠体内的吸收有降低作用。本实验从药动学角度验证了青娥方配伍的合理性。


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