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《兰州大学》 2017年
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抑制有氧糖酵解逆转白血病K562/ADM多药耐药细胞的耐药性

张雪燕  
【摘要】:多药耐药是导致肿瘤治疗失败的重要原因,大多数观点认为内外多种因素引发多药耐药性的产生,然而迄今为止对其发生和调控机制尚无清晰明确的认识。近年多项研究发现肿瘤细胞有氧糖酵解与其耐药性的产生密切相关。尽管肿瘤细胞有氧糖酵解现象的发现已逾90年,但其发生的分子调控机制特别是与肿瘤耐药性的关系仍然不明确。因此,从肿瘤细胞糖代谢的角度探寻多药耐药的机制,有针对性地寻找克服肿瘤耐药性的药物或策略,有望为临床肿瘤耐药的克服提供新的潜在靶点。本课题以白血病K562/ADM多药耐药细胞及其药物敏感的亲本K562细胞为模型细胞,比较研究了白血病耐药细胞与敏感细胞的葡萄糖代谢差异,研究发现常氧条件下白血病K562/ADM耐药细胞葡萄糖消耗和乳酸产生能力显著高于K562敏感细胞,且表现出对乳酸的依赖性,提示白血病耐药细胞的有氧酵解能力高于敏感细胞;白血病耐药细胞糖代谢的重编程可能通过酸化细胞微环境减少药物吸收、减少氧自由基抵抗氧化损伤、增加产能速率促三磷酸腺苷(adenosine triphosphate,ATP)依赖的药物外排等多种不同的方式导致细胞对抗癌药物的抵抗。葡萄糖代谢关键酶/蛋白的表达和活性检测表明白血病耐药细胞己糖激酶(hexokinase,HK)和丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)活性以及葡萄糖转运体4(glucose transports 4,GLUT4)、HK-Ⅱ的表达水平的增高,增强了耐药细胞的有氧糖酵解能力。采用2-脱氧葡萄糖(2-deoxy-D-glucose,2-DG)和草氨酸钠(oxamate,OX)两种糖酵解抑制剂干预白血病细胞的有氧糖酵解,证实抑制糖酵解能够增加白血病细胞对阿霉素(adriamycin,ADM)的敏感性,恢复K562/ADM耐药细胞对ADM的敏感性。上述研究结果提示K562/ADM细胞耐药性与有氧糖酵解的增强密切相关。采用二代测序(next generation sequancing,NGS)技术检测K562/ADM细胞和K562细胞的基因表达谱,转录组差异表达分析发现K562和K562/ADM细胞间存在79个葡萄糖代谢相关的差异基因,其中以药物毒物外排,通道调节和酶调节基因类的差异富集度最高,K562/ADM耐药细胞的糖分解代谢相关基因上调,三羧酸循环代谢基因下调。此外,KEGG信号通路注释发现葡萄糖代谢相关的多条信号通路存在差异基因的富集,其中以PI3K-AKT信号通路的富集水平最高,与K562细胞比较,K562/ADM细胞PI3K-AKT信号通路超活化,PI3K-AKT信号通路的异常活化可能通过增强有氧糖酵解介导了K562/ADM细胞耐药性。Western blot实验证实ADM上调AKT-mTOR-c-Myc/p-GSK-3β(Ser9)信号通路是导致阿霉素耐药的重要原因。糖酵解抑制剂能够显著抵抗ADM诱导的AKT-mTOR-c-Myc信号通路上调,且显著下调耐药细胞AKT-mTOR-HIF-GLUT4/HK-Ⅱ信号通路,增加ADM的细胞毒性,AKT-mTOR通路的下调是克服白血病耐药的关键所在。此外,糖原合成酶激酶-3β(glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β)在肿瘤细胞中是促癌还是抑癌因子目前观点并不一致,本研究显示GSK-3β在白血病细胞的生长中可能是一个“抑癌因子”,糖酵解抑制剂增敏耐药细胞的作用与GSK-3βSer9位点磷酸化的抑制,GSK-3β活性增加有关。白血病K562/ADM细胞对多种化疗药物都具有交叉耐受性,我们的研究证实三氧化二砷(arsenic trioxide,As_2O_3)对K562/ADM细胞的抑制作用反而略高于其亲本的K562敏感细胞。且As_2O_3能够显著下调耐药细胞AKT-mTOR-HIF信号通路中多个蛋白分子的表达及磷酸化水平,直接或间接地抑制HK-Ⅱ、LDH-A、GLUT4的表达,降低LDH-A、HK活性,增强LDH-B活性,显著抑制耐药细胞的葡萄糖消耗、引起丙酮酸堆积,从而抑制糖有氧糖酵解的流量,这可能是白血病K562/ADM耐药细胞对As_2O_3更为敏感的原因之一。有关As_2O_3对白血病细胞有氧糖酵解的影响的分子机制,有待进一步的实验论证。综合上述,白血病K562/ADM耐药细胞的有氧糖酵解能力显著强于其药物敏感的亲本K562细胞,抑制有氧糖酵解可显著减低K562/ADM细胞的药物耐受性。有氧糖酵解介导的白血病细胞耐药性与AKT-mTOR-c-Myc/HIF/GSK-3β通路密切相关。As_2O_3通过抑制K562/ADM耐药细胞AKT-mTOR-HIF-1a信号通路显著降低糖有氧酵解,进而抑制能量供应是K562/ADM耐药细胞对As_2O_3敏感的重要因素。本研究从耐药性白血病细胞糖代谢特点的角度,提出了通过抑制有氧糖酵解或下调促进有氧糖酵解的信号通路逆转白血病细胞耐药性的新策略,有望为临床难治性和耐药性白血病/肿瘤的治疗提供理论和实验依据。
【学位授予单位】:兰州大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R73-36

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