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《兰州大学》 2017年
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蕨麻多糖对镉所致肾毒性的保护作用及其机制研究

沈蓉  
【摘要】:镉(Cadmium,Cd)是一种有毒重金属,广泛存在于土壤、水质、空气中。环境中的Cd不能被生物代谢降解,导致Cd经食物链传递不断蓄积在动物及人体内。Cd因其理化特性与锌相似,容易取代体内的钙、锌、镁等离子,在机体内长期蓄积而引发疾病。Cd致机体损伤的程度依赖于进入机体的Cd的剂量、存在形式及暴露时间,进入机体内的Cd可经血液循环分布于全身各处,特别是肾、肝、脾、胸腺、骨等器官。肾小管的重吸收作用导致Cd在肾脏内大量蓄积,诱发组织细胞损伤、线粒体功能障碍及细胞凋亡的发生。目前,Cd中毒的防治主要以重金属螯合剂及抗氧化剂为主,也有研究表明多种中草药提取物可防治慢性Cd中毒所致的肾损伤、改善慢性中毒症状。蕨麻是一种食药两用型传统中药,含有丰富的营养物质,其中蕨麻多糖(Potentilla anserina polysaccharides,PAP)因其具有明确的生物学活性而受到关注,在体内及体外实验中均被证实具有抗氧化、抗凋亡、免疫调节等多方面的作用。目的:基于PAP具有抗氧化、抗凋亡及调节免疫等生物活性,对Cd所致的损伤具有针对性,本研究拟建立Cd染毒细胞及动物模型,观察分析Cd在细胞及器官内的分布及定量;PAP干预,探讨PAP对Cd所致细胞及动物肾毒性的保护作用及其相关机制。方法:1.水提醇沉法提取PAP,Sevage法脱蛋白纯化,红外光谱分析法、苯酚-硫酸法及HPLC法检测。2.建立Cd染毒细胞及动物模型,合成Cd2+荧光探针,激光共聚焦显微技术定位并半定量分析细胞及动物脏器内的Cd2+分布,HE染色观察各器官的组织病理学改变。3.建立Cd染毒HEK293细胞模型,PAP干预,CCK-8法测定细胞活力,荧光染色观察细胞凋亡、线粒体膜电位、活性氧水平,ELISA法检测细胞内GSH、SOD、MDA、ATP水平,流式细胞术检测细胞凋亡率,Western blotting实验检测线粒体合成及功能相关蛋白、内源性及外源性凋亡相关蛋白的表达。4.建立急性及慢性Cd染毒动物模型,PAP干预,免疫组化染色法及Masson’s染色法观察肾脏组织病理学改变、纤维化进展,采用上述方法测定肾脏功能、氧化还原状态、线粒体功能及合成相关蛋白、内外源性凋亡相关蛋白的表达。结果:1.青海玉树蕨麻提取样品中多糖含量可达64.22%,PAP提取样品中含有糖类的特征基团,其主要单糖组分包括葡萄糖、半乳糖醛酸、阿拉伯糖、半乳糖、氨基葡萄糖、鼠李糖、氨基半乳糖和木糖。2.荧光探针染色表明Cd2+弥散分布于胞质中,在部分特定的细胞器呈密集分布。荧光染色显示小鼠体内以肾脏中Cd2+蓄积量最高,且Cd2+主要分布于肾小管上皮细胞内,其次为肝、脾、胸腺及睾丸。3.PAP可改善Cd染毒细胞的细胞活力、减少细胞坏死及凋亡;升高GSH及SOD水平、降低ROS及MDA含量,改善氧化还原状态;恢复线粒体膜电位及ATP水平,调控PGC-1α和Nrf2蛋白表达;降低Cd染毒细胞的凋亡率,并可上调bcl-2蛋白表达及bcl-2/bax比值,下调γH2ax、p-p53、cytochrome C、Cleaved-Caspase 3及Fas蛋白的表达,其抗凋亡作用可能涉及调控线粒体介导的内源性凋亡途径及死亡受体介导的外源性凋亡途径。4.PAP可改善急、慢性Cd染毒小鼠肾脏指数,恢复肾脏功能,提高GSH水平、降低MDA含量,调控肾脏细胞PGC-1α及Nrf2表达,缓解肾脏组织病理学改变及肾脏纤维化进展,上调bcl-2/bax蛋白表达比值,下调Fas蛋白表达,可能参与调控细胞内源性及外源性凋亡途径对抗Cd诱导的肾脏组织细胞凋亡。结论:PAP可改善Cd所致的细胞损伤、肾功能降低、线粒体完整性及线粒体功能下降、核DNA损伤、减轻Cd诱导的肾脏组织病理学改变,具有抗氧化及抗凋亡的作用,对Cd所致的肾毒性具有较明显的保护作用。
【学位授予单位】:兰州大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R285.5

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