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《兰州大学》 2017年
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黑骨藤抗炎作用及质量控制研究

董莉  
【摘要】:黑骨藤药材属于萝藦科植物中杠柳属——黑龙骨Periploca forrestii Schltr.的干燥根或全株,民间广为流传的优质中药材。主要功效为通经、活血、解毒、祛风,常用于治疗跌打损伤、风湿、关节痛、月经不调等病症,以其为主药的上市品种黑骨藤追风活络胶囊、枫荷除痹酊、复方仙灵风湿酒、生龙驱风药酒等,在临床上发挥了较好的治疗作用。黑骨藤主要的化学成分包括甾体苷、强心苷、低聚糖、香豆素、黄酮、三萜类,药理实验证明其具有抗癌、抗炎、镇痛、强心、免疫抑制及抗氧化等作用,但其抗炎的有效组分及作用机制还有待进一步研究。且该药材现行标准中仅记载了其性状和理化鉴别,这在一定程度上限制了黑骨藤药材的应用,同时也说明黑骨藤药材在质量控制方面有待完善。基于此,本研究对黑骨藤抗炎有效组分进行筛选、体内抗炎作用、作用机制、化学成分分析以及质量标准进行了研究,为阐明黑骨藤的抗炎作用机理提供了理论基础,为药材质量标准的制订与临床应用提供了科学依据。1.采用脂多糖(LPS)诱导的RAW 264.7细胞体外炎症模型,对黑骨藤水组分(WFPF)、10%乙醇组分(EFPF)、50%乙醇组分(50%EFPF)、95%乙醇组分(95%EFPF)进行抗炎活性筛选,明确其抗炎的有效组分。采用MTT法检测细胞存活率、Griess试剂法检测细胞上清液中一氧化氮(NO)含量、酶联免疫法(ELISA)法检测细胞上清液中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的含量,考察了黑骨藤不同组分的抗炎活性。实验结果显示黑骨藤中EFPF抑制LPS诱导的RAW 264.7细胞释放NO和TNF-α的作用较优,表明EFPF为黑骨藤抗炎的有效组分。2.采用超高效液相色谱-四极杆飞行时间串联质谱(UHPLC-Q-TOF-MS)联用的技术对黑骨藤抗炎有效组分EFPF中的主要化学成分进行表征,通过对各色谱峰的保留时间、分子量、分子式、紫外吸收、二级质谱等信息进行分析,并结合对照品和文献比对,对有效组分中的8个主要化学成分峰进行了表征。化学成分分析表明,EFPF中主要含有1-O-咖啡酰基奎宁酸(1-CQA)、3-O-咖啡酰基奎宁酸(3-CQA)、5-O-咖啡酰基奎宁酸、4-O-咖啡酰基奎宁酸、9-O-咖啡酰基奎宁酸、1-O-咖啡酰基奎宁酸乙酯、3-O-咖啡酰基奎宁酸乙酯、4-O-咖啡酰基奎宁酸乙酯(4-CDOA)等各种咖啡酰基奎宁酸类化合物,为进一步阐释其药效物质基础提供了依据。3.采用醋酸致小鼠腹腔毛细血管通透性增高、二甲苯致小鼠耳肿胀和角叉菜胶致大鼠足趾肿胀的动物体内炎症模型,对筛选得到的黑骨藤抗炎有效组分EFPF进行了体内抗炎药效研究。结果显示,EFPF能显著降低小鼠腹腔毛细血管通透性、二甲苯诱导的小鼠耳廓肿胀和角叉菜胶诱导的大鼠足趾肿胀。提示EFPF具有较好的体内抗炎活性。4.进一步研究EFPF对RAW 264.7细胞凋亡、炎症介质和炎症因子分泌、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和环氧合酶2(COX-2)等相关调控蛋白表达的影响以及核转录因子-κB(NF-κB)、丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信号通路的情况,探讨EFPF的抗炎作用机制。采用AO/EB染色法和流式细胞技术检测EFPF对LPS诱导的RAW 264.7细胞形态变化、凋亡率、活性氧(ROS)和线粒体膜电位(MMP)影响;采用Griess试剂法测定RAW 264.7细胞中NO的含量;采用ELISA法检测细胞上清液中前列腺素E2(PGE2)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白介素6(IL-6)和白介素10(IL-10)的分泌水平;应用荧光定量PCR技术(RT-PCR)测定RAW264.7分泌细胞因子(TNF-α、IL-6、IL-10)mRNA表达的情况;采用免疫印迹法(Western blot)检测iNOS和COX-2蛋白表达以及NF-κB、MAPKs(细胞外信号调节激酶-ERK、C-jun氨其未端激酶-JNK、p38丝裂原活化蛋白激酶-p38 MAPK)信号通路相关调控蛋白的表达。实验结果显示,与LPS模型组相比,EFPF剂量显著降低LPS诱导的RAW264.7细胞凋亡率、ROS的含量和MMP(P0.05,P0.005,P0.001);显著抑制LPS诱导的RAW264.7细胞中炎症介质NO、PGE2(P0.05)和炎症因子TNF-α、IL-6的分泌(P0.05),增加IL-10的产生(P0.05);显著抑制TNF-a、IL-6和提高IL-10的mRNA表达量(P0.005,P0.001);显著抑制细胞中i NOS和COX-2的蛋白表达(P0.05,P0.001),降低NF-κB信号通路中p-IκBα和p65蛋白的表达(P0.05,P0.001),抑制IκBα蛋白降解(P0.05,P0.001);并抑制MAPKs信号通路中p38、ERK1/2和JNK的磷酸化(P0.05,P0.005)。结果表明EFPF主要通过抑制细胞凋亡,ROS的过量产生及稳定MMP、调控NF-κB和MAPKs信号通路来降低TNF-α,IL-6,NO和PGE2等炎症因子的产生以及抑制i NOS和COX-2蛋白表达,从而发挥EFPF的抗炎作用。5.通过对不同产地黑骨藤药材总咖啡酸酯含量、多指标含量测定及指纹图谱的研究,建立了紫外-可见光分光光度测定药材中总咖啡酸酯含量和超高效液相色谱法测定多指标成分定量控制方法,并对指纹图谱进行了研究,同时进行了水分、总灰分、酸不溶性灰分及有机氯农药残留等相关项目的检查,完善了黑骨藤药材的质量控制标准,为黑骨藤药材的开发应用提供科学依据及理论基础。
【学位授予单位】:兰州大学
【学位级别】:博士
【学位授予年份】:2017
【分类号】:R285;R284

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